Ɛntäämɛ *Gua̱a̱th in tä thi̱n ɛn täämɛ: Kɔlɔn 50931, Jiɛrmani̱, Kɔlɔn Ɛkthɛlli̱n Ki̱la̱thtɛr Rithääc kä Thëllular I̱thti̱rɛth Ri̱thpɔnth rɛy Jua̱thni̱ tin thi̱ääk kɛ dɔŋ (CECAD).
Kä nio̱rödejenerecin duŋ jua̱thni̱ mai̱tökɔndi̱rial ɛ mi̱ ca guic i̱ /cɛ rɔ bi̱ luɔc jɔk kɛ ɣöö ɛn mɛtabölik pla̱thtikthi̱ti̱ duŋ nio̱rɔni̱ ɛ mi̱ kuiy, duŋni̱ ɣöö min no̱o̱ŋ mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn kä thëll autönomi̱ duŋ nio̱rɔnal mɛtaböli̱dhi̱öm rɛy pua̱a̱ny ɛ mi̱ /ka̱nɛ ŋa̱c ɛ gɔaa. Ɛn wa̱nɛ, banɛ thëll-i̱thpethi̱pik prötieöm duŋ Purkinje nio̱rɔni̱ nööŋ kɛ prögi̱rɛthib OXPHOS depi̱ciɛn min nööŋkɛ ɛ mai̱tökɔndi̱rial puciɔn dai̱namikni̱ min ci̱ ya̱r. Cu nɛy ɛ jiek ɛn ɣöö mai̱tökɔndi̱rial /cɛ lät ɛ gɔaa cuɛ nööŋni̱ gër mi̱ di̱i̱t rɛy pi̱e̱lä duŋ prötieömikni̱, kɛ jɔakdɛ cuɛ thi̱kuɛncial ɛkti̱bɛciɔn duŋ metɛbölik prögi̱ra̱mni̱ ti̱ cuŋ ɛ ŋot /ken thëll ni̱ li̱w. Ɛ /ka̱nɛ liip, cua jiek ɛn ɣöö bɛ pai̱rubat karbökthai̱lathe (PCx) kɛnɛ peröɣɛdatheth kɔ̱kiɛn ti̱ thi̱ääk kɛ mat TCA thärkäl intɛrmediëti̱ni̱. Kä ga̱ŋ PCx cuɛ ɣɔkdhi̱dɛtip i̱thti̱rɛth kɛnɛ nio̱rödejenerecin jakä di̱t, cuɛ nyoth i̱ athɛröthkɛlɛröthith tëkɛ mi̱ gaŋɛ rɛy nio̱rɔni̱ tin thiɛl OXPHOS. Kä luɔ̱c mai̱tökɔndi̱rial puciɔn rɛy tɛrmi̱nalli̱ dejenerɛted nio̱rɔni̱ bɛ ciɛŋ metɛbölik ti̱ti̱ luɔc jɔk kɛɛliw, kɛ kui̱c ɛmɔ bɛ thëlli̱ gaŋ kɛ lia̱a̱. Kä min ca jiek kä kɔn cuɛ dup ti̱ /ka̱n ŋa̱c ni̱ wal nyoth min jak mai̱tökɔndi̱rial kä lät ɛ bum kɛnɛ ɣöö cuɛ nyoth i̱ neurödejenerecin dɔ̱ŋ bɛ rɔ luɔc jɔk määni̱ rɛy gua̱thni̱ tin jɔak kä juey.
Kä la̱t in di̱tni̱ jɛn kä mai̱tökɔndi̱ria rɛy rɔmä nio̱rɔnal enerji̱ mɛtaböli̱dhi̱öm ɛ mi̱ ca la̱th lät ɛ nyuuthni̱ neurölöji̱kal ti̱ ŋuan ti̱ thi̱ääk kɛ jua̱th mai̱tökɔndi̱ria ran. Ri̱w jua̱thni̱ ti̱ti̱ laa kɛ laa nööŋkɛ ɛ ji̱i̱n mutɛciɔni̱ tin laa mai̱tɔkɔndi̱rial ji̱i̱n laa nyoothɛ (1, 2) kiɛ däk ji̱i̱nä mi̱ thi̱ääk kɛ mai̱tɔkɔndi̱rial dai̱na̱mikni̱, min laa ya̱rɛ i̱thta̱bi̱li̱ti̱ duŋ mai̱tökɔndi̱rial DNA (mtDNA) (3, 4). La̱t rɛy mödɛli̱ leeni̱ cuɛ nyoth i̱ rɛy lucä kä mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn rɛy ti̱cuni̱ tin caa göl piny, kɔntherbɛtip metɛbölik pathwayni̱ (5-7) dɔ̱ŋ bɛ lät, kɛ kɔrɛ bɛ cu nööŋni̱ ŋäc mi̱ gɔa rɛy pa̱thöjenethi̱th duŋ jua̱thni̱ ti̱ti̱ ti̱ gööl. Mi̱ gua̱c ɛlɔ̱ŋ, ɛn ŋäcdan kɛ gër mɛtabölik kä thëlli̱ ti̱ caa lɛy tin nööŋkɛ ɛ ŋith mi̱ ci̱ mai̱tökɔndi̱rial adenöthin trai̱pöthpët (ATP) pröda̱kciɔn ɛ mi̱ di̱i̱t (8), cuɛ guic ni̱ ɣöö ba therapeutik targɛtni̱ ŋa̱c min dë la̱t kɛ ga̱ŋ kiɛ ga̱ŋ jua̱thni̱. Gaŋ nio̱rödejenereciɔn (9). Kä thiɛl lääri̱ ɛ jɛn ɣöö närb thëlli̱ kɛn cua kɛ guic ɛlɔ̱ŋ i̱ tekɛ mi̱ tɔt mi̱ la metɛbölik flekthi̱bili̱ti̱ mi̱ pa̱a̱rkɛ kɛ thëlli̱ tin caa göl piny (10). Kɛ min ca ŋun i̱ thëlli̱ ti̱ti̱ tekɛ luäŋ mi̱ di̱i̱t rɛy matdä min nööŋkɛ ɛ metɛbölai̱teth ɛ wä kä nio̱rɔni̱ kɛ rëp thai̱na̱ptik tra̱ni̱thmi̱ciɔn kɛnɛ luɔ̱cdɛ kɛ min ci̱ tuɔɔk kɛnɛ ta̱a̱ jua̱thni̱, ɛn lua̱ŋ in bi̱ thëlli̱ metɛböli̱dhi̱öm rɔ gɛr kɛ ta̱a̱ in bɛc bɛc kä ŋith ti̱cuth cuɛ thia̱k kɛ guut kä thɛli̱ glial (11-14). Ɛ nyɔk bä, ɛn inɣɛrent thëllular ɣe̱ti̱röjenei̱ti̱ duŋ ŋithä ti̱cuth la gaŋɛ ŋi̱i̱c gër metɛbölik min la tuɔɔk rɛy nio̱rɔnal tha̱bgurupni̱ ti̱ caa lɛy. Kɛ kɔrɛ, mi̱ tɔt mi̱ ŋa̱ckɛ kä thëllular kɛnɛ mɛtabölik min bi̱ ben raar kä mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn rɛy nio̱rɔni̱.
Kɛ ɣöö ba min bi̱ ben raar kä mɛtabölik ŋa̱c mi̱ ci̱ mai̱tökɔndi̱rial /thiɛl la̱t, cua Purkinje nio̱rɔni̱ (PNs) da̱a̱k rɛy gua̱thni̱ ti̱ gööl kä nio̱rödejenerecin min nööŋkɛ ɛ däk mai̱tökɔndi̱rial raar membi̱ran puciɔn (Mfn2). Cieŋni̱ min Mfn2 mutɛciɔni̱ rɛy nath kɛn thi̱ääk kɛ ta̱a̱ ɣereditɛri̱ mötɔr thɛnthöri̱ nio̱röpathi̱ mi̱ ŋa̱ckɛ cie Charkɔt-Marie-Tooth ta̱a̱ 2A (15), kä min ca ya̱r ɛ Mfn2 rɛy kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ ɛ mi̱ ca ŋic-ɛ gɔaa kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ ɣɔkdhi̱dɛciɔn Pöthpöri̱lɛciɔn (OXthöPöth) di̱thpa̱ŋciɔn. Kä nio̱rɔnal tha̱btaapni̱ ti̱ gööl (16-19) kɛnɛ min ci̱ ben raar kä nio̱rödejenerɛtib pënötaap kɛn wäkɛ kɛɛl kɛ prögi̱rɛthib neo̱rölöji̱kal thi̱mptɔmni̱, ce̱tkɛ mi̱ cie ja̱l mi̱ /ci̱ rɔ lot (18, 19) kiɛ cerebellar atadhia (16). Mi̱ ca mat kɛɛ lɛbel-ɣi̱ri̱ kua̱nti̱tɛtib (LFQ) prötieömikni̱, mɛtabölömikni̱, i̱mëjiŋ, kɛnɛ bai̱rölo̱ji̱kal methɔdni̱, kɔn cua nyoth i̱ prögi̱rɛthib nio̱rödejenerecin cuɛ pai̱rubat karbökthai̱lathe (PCx) nööŋ ɛ bum kɛnɛ paktɔri̱ kɔ̱kiɛn tin te rɛy arteriöthkɛlɛröthith duŋ PNni̱ rɛy bi̱bö Kä nyuɔ̱th endhɛmni̱. Mi̱ görkɛ ɣöö ba ŋa̱c i̱ lotdɛ rɔ kɛ min ca jiek ɛmɛ, kɔn cua la̱th piny-rɛgulɛciɔn duŋ PCx rɛy Mfn2-depi̱ciɛn PNni̱, kɛnɛ ɣöö cua jiek ɛn ɣöö öperɛciɔn ɛmɛ cuɛ ɣɔkdhi̱dɛtip i̱thti̱reth jakä di̱t kɛnɛ ɣöö cuɛ neurödejenerecin jakä pɛ̈th, kɛ kɔrɛ cuɛ nyoth i̱ adhööthpermia cuɛ thëll li̱a̱a̱ Metabolik ada̱ptabi̱li̱ti̱ nööŋ. Ɛkpreciɔn mi̱ bɛc bɛc kä MFN2 bɛ termi̱nal dejenereciɔn PN luäk kɛɛliw kɛ dak OXPHOS mi̱ di̱i̱t, mi̱ naŋ mai̱tökɔndi̱rial DNA mi̱ di̱i̱t, kɛnɛ mi̱ ci̱ mai̱tökɔndi̱rial nɛtwɔk däk, min bi̱ ŋot kɛ mi̱ latɛ jɛ ɛn ɣöö ɛn ta̱a̱ neurödejenereciɔn ɛmɛ bɛ rɔ cu luäŋ kɛ jiëc rɛy thëll in ci̱ juey ni̱ cop.
Rɛy kä ɣöö ba mai̱tökɔndi̱ria guic rɛy Mfn2 knɔkkaut PNni̱, cua la̱t kɛ muɔth i̱thtrain min jak Cre-diɛn kä mai̱tökɔndi̱ria kɛ targɛt yellow pluorethɛn prötien (YFP) (mtYFP) (20) Cre latdɛ kɛnɛ ɣöö cua mai̱tökɔndi̱rial mörpölöji̱ guic rɛy bi̱bö. Cu nɛy ɛ jiek ɛn ɣöö ɛn däk Mfn2 ji̱i̱n rɛy PNni̱ bɛ cu nööŋni̱ dääk ɛ määth kä mai̱tökɔndi̱rial netwɔk (Pi̱guur S1A), kɛnɛ ɣöö ɛn gër ëë nhiam cua jiek rɛy juɔkni̱ 3 ti̱ ci̱ cop. Mi̱ gua̱c, ɛn thɔ̱bi̱thtancial dejenerɛciɔn duŋ PN thëll lɛyɛr, cie min ca nyoth ɛ min ci̱ bath kä Kalbindin immi̱o̱nöthtainiŋ, /känɛ tuɔɔk amääni̱ mëë ci̱ juɔkni̱ 12 cop (Pi̱guur 1, A kɛnɛ B). Kä thaak in /ci̱ päär kam gër ëë nhiam rɛy mai̱tökɔndi̱rial mörpölöji̱ kɛnɛ min jɔc kä tuk li̱eth nio̱rɔnal cuɛ kɔn jakä ɣöö banɛ gër metɛbölik go̱r min nööŋkɛ ɛ mai̱tökɔndi̱rial mi̱ /ci̱ lät ɛ ŋot /ken thëll ni̱ li̱w. Cu nɛy ɛ ka̱m raar ɛ la pluorethcen-akti̱bɛted thëll thɔ̱rtiŋ (FACS)-bɛth i̱thtrateji̱ kɛ ai̱thölɛciɔn YFP (YFP+)-ɛkpreththiŋ PN (Pi̱guur 1C), kɛnɛ rɛy kɔnti̱röl kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ (Mfn2 + / lödhP :: mtYFP lödhP- thɔ̱p-lödhP: : L7-cre), kɛ kɔrɛ ba cu cɔl i̱ CT1BRL (Pi̱guur). Kä öpti̱mai̱dhëcin duŋ gatiŋ i̱thtrateji̱ min tekä ri̱lɛtib intenthi̱ti̱ duŋ YFP thi̱knal jakɛ kɔn kä ɣöö ba puɔ̱ny YFP+ (YFPhigh) duŋ PNni̱ riali̱kä ɛ jiɛn kä nɔ̱n-PNni̱ (YFPneg) (Pi̱guur S1B) kiɛ putatip pluorethɛn adhɔn/dendritik pragmɛni̱ (YFPlow; Thurɛ S1D, kɔnpöpöpölw, caam),). Rɛy kä ɣöö ba ŋic i̱ ɛ puɔ̱pulëcin in ca da̱a̱k, cua LFQ prötieömikni̱ la̱t kɛnɛ kɔrɛ cua pri̱nthi̱pɔl kɔmpönɛnt anali̱thi̱th la̱t, kɛnɛ ɣöö cua jiek ɛn ɣöö tëkɛ dääk mi̱ jɔc kam YFPhigh kɛnɛ YFPneg thëlli̱ (Pi̱guur S1C). YFPhigh thëlli̱ cuɛ nyothni̱ net enri̱ci̱mɛn duŋ PNni̱ markɛri̱ ti̱ ŋa̱ckɛ (c.d. Calb1, Pcp2, Grid2 kɛnɛ Itpr3) (21, 22), duŋni̱ ɣöö cuɛ thiɛl enri̱ci̱mɛn duŋ prötieni̱ mi̱ la jɔc ni̱ ciaaŋ rɛy nio̱rɔni̱ kiɛ thëlli̱ kɔ̱kiɛn (Pi̱guur 1D) ). Ɛ pääri̱ kam tha̱mpuɔli̱ rɛy ki̱la̱ththi̱pi̱d YFPhigh thëlli̱ tëë ca ruuli̱ rɛy ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ ti̱ cuŋ kärɔ̱ cuɛ nyothni̱ kɔrrelɛcin köëppi̱ciɛn> 0.9, cuɛ nyothni̱ di̱e̱th mi̱ gɔa kam baölöji̱kal replikëtni̱ (Pi̱guur S1E). Rɛy ŋaknɔmä, kɛn data ni̱ ti̱ti̱ cua ca̱pda nyoth kɛ kui̱ akuut kɛnɛ i̱thpethi̱pik ai̱thölɛciɔn duŋ PN min de rɔ lot. Kɛ ɣöö ɛn L7-cre driver thi̱thtɛm in lät kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ möthiak rekɔmbainɛciɔn rɛy juɔk in nhiam kɛ kɔr dapä (23), cua kɔ tok kɛ näk kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ kä CTRL kɛnɛ kɔndi̱ciɔnal (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-i̱thtɔp-loxP :: L7-cre) Ruuli̱ nio̱rɔni̱. Kɛ kɔr kä mëë ci̱ ri̱kɔmbainɛciɔn thuɔ̱k, jɛn ba cu cɔli̱ Mfn2cKO kɛ kɔr juɔkni̱ da̱ŋ ŋuaan. Cie guutdɛ, cua kɔ kuany kɛ juɔkni̱ 8 ti̱ tekɛ run mëë ci̱ PN lɛyɛr ŋotdɛ te thi̱n cieŋni̱ mëë cuɛ jɔɔc ɛn mai̱tökɔndi̱rial fragmɛni̱ (Pi̱guur 1B kɛnɛ Pi̱guur S1A). Rɛydɛ kɛɛliw, cua pek prötieni̱ ti̱ 3013 kuɛn, min cu 22% cu tekä MitöKarta 2.0 annötɛciɔni̱ ti̱ tekä mai̱tökɔndi̱rial prötieöm cie mai̱tökɔndi̱ria (Pi̱guur 1E) (Pi̱guur 1E) (24). Kä di̱fferencial ji̱i̱n ɣɛkprɛciɔn anali̱thi̱th cua la̱t rɛy juɔk 8 cuɛ nyoth i̱ jɛn 10.5% kärɔa kä prötieni̱ diaal cuɛ tekɛ mi̱ ci̱ rɔ gɛr mi̱ di̱i̱t (Pi̱guur 1F kɛnɛ Pi̱guur S1F), min cu prötieni̱ 195 cua kɛ wä piny-regulated kɛnɛ prötieni̱ 120 cua kɛ rep-regulated (Pi̱guur 1F). Jɛn gɔaaɛ ɛn ɣöö ba ŋa̱c i̱ jɛn "innöbɛtip pathway anali̱thi̱th" duŋ data thɛt ɛmɛ nyothɛ jɛ i̱ ji̱i̱ni̱ tin ca nyoth kɛ dääkdiɛn ɛlɔ̱ŋ tekɛ kä thɛt mi̱ ca gaŋ kä pathway metɛbölik mi̱ ca lɛy (Pi̱guur 1G). Ɛn min gɔaa ɛlɔ̱ŋ, cieŋni̱ min laa dup tin laa wɔ̱ piny ɛ wɔ̱ piny tin thi̱ääk kɛ OXPHOS kɛnɛ kalthi̱öm thi̱knaliŋ laa jɛ laa nyoothɛ ɛn ɣöö /thiɛlɛ mi̱ lät kä mai̱tɔkɔndi̱rial rɛy puciɔn-depi̱ciɛn PNni̱, kɛn bua̱n tin kɔ̱kiɛn tin tä rɛy aminɔ athid mɛtabɔli̱dhiöm laa kɛ laa jakɛ kä wɔ̱ nhial, min ku laa wɔ̱ kɛɛl kɛ mai̱tɔkɔndi̱rial mɛtabɔli̱dhi̱öm in laa tuɔɔk. Rewiring ɛ mi̱ la te thi̱n ni̱ ciaaŋ. di̱thpa̱ŋciɔn.
(A) Pötögra̱pni̱ kɔnpökal ti̱ cuŋ kɛ kui̱ cerebellar thɛkcini̱ nyin CTRL kɛnɛ Mfn2cKO kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ nyothkɛ ni̱ ɣöö ci̱ PNni̱ wä kɛ mi̱ bath (calbindin, grey); ni̱kli̱öni̱ cua kɛ kɔntɛri̱thtɛin kɛ DAPI. (B) Kuanti̱pi̱këcin duŋ (A) (duɔ̱ɔ̱p-kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱, ***P<0.001; n = 4 ɛ wä kä 6 thärkäli̱ kä kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ diɔ̱k). (C) Ɣɛkpi̱ri̱mɛntal la̱tdɛ. (D) Ɣi̱th map dääk markɛri̱ ti̱ caa lɛy kä Purkinje (nhial) kɛnɛ thëlli̱ kɔ̱kiɛn (däär). (E) Benn diagram nyothɛ nämbär duŋ mai̱tökɔndi̱rial prötieni̱ tin ca ŋa̱c rɛy PN min ca da̱a̱k. (F) Bolkanö plɔt duŋ prötieni̱ ti̱ ca nyoth kɛ dääk rɛy Mfn2cKO nio̱rɔni̱ kä juɔkni̱ 8 (thi̱gni̱pi̱kan cut-ɔp ba̱li̱ö duŋ 1.3). (G) Kä ca̱p ca̱p anali̱thi̱th cuɛ nyothni̱ dup tin di̱t kä dhie̱e̱c tin te nhial-regulɛciɔn (red) kɛnɛ down-regulɛciɔn (blue) rɛy Mfn2cKO PN min ca da̱a̱k cie juɔkni̱ 8. Kä aberig ɣɛkprɛciɔn lɛbel duŋ prötien kärɔa min ca jiek cua nyoth. Gi̱rɛyi̱thki̱ɛl lëth map: cua P ba̱li̱ö riali̱kä. ns, /cɛ gɔaa.
Prötieömikni̱ data cuɛ nyoth i̱ prötien ëë ca nyoth kä kɔmpi̱lɛkni̱ I, III, kɛnɛ IV cuɛ wä piny ɛ määth. Kɔmpi̱lɛkni̱ I, III, kɛnɛ IV kɛndiaal tekɛ mtDNA-enkɔɔdid tha̱buni̱ti̱ni̱ ti̱ gɔw, niɛ gua̱a̱ mɔ kɔmpi̱lɛk II, min cu ni̱kli̱e̱e̱r-kɔɔdid kärɔa, cuɛ tekɛ mi̱ cuɛ ya̱r (Pi̱guur 2A kɛnɛ Pi̱guur S2A). . Ɛ wä kɛɛl kɛ min ci̱ ben raar kä prötieömikni̱, immi̱o̱nöɣi̱thtökemi̱thti̱ri̱ duŋ cerebellar ti̱cuth thɛkcini̱ cuɛ nyoth i̱ jɛn MTCO1 (mai̱tökɔndi̱rial thai̱tökrɔm C ɣɔkthadɛth tha̱buni̱t 1) tha̱buni̱t lɛbel duŋ kɔmpi̱lɛk IV rɛy PN cuɛ wä piny ɛ määth (Pi̱guur 2B). Kä mtDNA-enkɔɔd tha̱buni̱t Mtatp8 cuɛ kuɛ̈ɛ̈ ɛ lɔ̱ŋ (Pi̱guur S2A), niɛ gua̱a̱ mɔ cu i̱thtëdi̱-i̱thtët lɛbel duŋ ni̱kli̱e̱e̱r-enkɔɔdid ATP thi̱nthathe tha̱buni̱ti̱ cuɛ ŋot ɛ /thiɛlɛ mi̱ ci̱ rɔ gɛr, min cu te thi̱n kɛ min ŋa̱ckɛ i̱ ɛ i̱thtɛbuɔl ATP thi̱nthathe tha̱baththembɛli̱ F1 kɔmpi̱lɛk mi̱ ci̱ mtDNA latdɛ ɛ i̱thtɛbuɔl. Kä tukdɛ ɛ mi̱ la te thi̱n ni̱ ciaaŋ. Käpdɛ raar (7). Ɛvaluëcin duŋ mtDNA lɛbel rɛy kä min ca kuany kä Mfn2cKO PNni̱ ɛ ri̱i̱l-tai̱m pöli̱merathe cɛɛn riakciɔn (qPCR) cuɛ nyoth i̱ jɛn wä piny ɛ määth rɛy mtDNA kɔpi̱ nämbärä. Mi̱ pa̱a̱rkɛ jɛ kɛ buɔ̱n in guɛckɛ, kä juɔkni̱ 8 kɛ run, cuɛ tekɛ 20% kärɔa kä mtDNA lɛbel cua rɔm thi̱n (Pi̱guur 2C). Ɛ wä kɛɛl kɛ tin ci̱ ben raar, ɛn kɔnpökal mai̱kröthkɔɔpi̱ i̱thtɛniŋ duŋ Mfn2cKO PNni̱ kɛ ŋi̱e̱c DNA nyothɛ thaak-in tekä min naŋkɛ ɛ mai̱tökɔndi̱rial ni̱kli̱ötaidni̱ (Pi̱guur 2D). Cu nɛy ɛ jiek ɛn ɣöö tha̱a̱ŋ kandi̱dɛtni̱ kärɔ̱ cukɛ te rɛy mai̱tökɔndi̱rial prötien degradɛciɔn kɛnɛ i̱thti̱rɛth ri̱thpɔn cua kɛ rep-regulated, cu määni̱ Lonp1, Afg3l2 kɛnɛ Clpx, kɛnɛ OXPHOS kɔmpi̱lɛk aththembɛli̱ paktɔri̱. /Thiɛlɛ mi̱ cua ŋa̱c mi̱ ci̱ rɔ gɛr rɛy lɛbeli̱ prötieni̱ tin te rɛy ɣapöptöthi̱th cua kɛ jiek (Pi̱guur S2B). Päärkɛ, cua jiek ɛn mai̱tökɔndi̱ria kɛnɛ endöpla̱thmik retikulum canɛli̱ tin te rɛy ja̱l kalthi̱öm tekɛ mi̱ tɔt mi̱ ci̱ rɔ gɛr kärɔa (Pi̱guur S2C). Ɛ matkɛ nɛmɛ thi̱n, ɛn evaluëcin duŋ ötɔpagi-related prötieni̱ cuɛ thiɛl mi̱ ci̱ rɔ gɛr mi̱ cua jiek, min cu te thi̱n kɛ indukciɔn mi̱ jɔc kä ötɔpagöthɔmni̱ cua guic rɛy bi̱bö ɛ immi̱o̱nöɣi̱thtökemi̱thti̱ri̱ kɛnɛ elɛkti̱rɔn mai̱kröthkɔɔpi̱ (Pi̱guur S3). Cieŋni̱ min, ɛn prögi̱rɛthib OXPHOS di̱thpa̱ŋciɔn rɛy PNni̱ ɛ mi̱ la wä kɛɛl kɛ gër alti̱rai̱thtra̱kciɛral mai̱tökɔndi̱rial mi̱ jɔc. Mi̱tökɔndi̱rial ki̱la̱thtɛri̱ cua kɛ nɛn rɛy pua̱nyni̱ thëlli̱ kɛnɛ jiɛn dendritik nyin Mfn2cKO PNni̱ tin tekɛ run 5 kɛnɛ juɔkni̱ 8, kɛnɛ ɣöö ɛn rɛy membi̱ran i̱thtra̱kciɛr cuɛ tekɛ mi̱ ci̱ rɔ gɛr ɛlɔ̱ŋ (Pi̱guur S4, A kɛnɛ B). Ɛ wä kɛɛl kɛ gër alti̱rai̱thtra̱kciɛral ti̱ti̱ kɛnɛ min ci̱ wä piny ɛ lɔ̱ŋ rɛy mtDNA, anali̱thi̱th duŋ akuut cerebral thɛrɛbellar i̱thlai̱thni̱ kɛ tetramethylrhödamin methyl ethter (TMRM) cuɛ nyoth i̱ jɛn mai̱tökɔndi̱rial membi̱ran buɔ̱mdɛ rɛy Mfn2cKO PNni̱ cuɛ wä piny ɛ lɔ̱ŋ (Pi̱guur S4C).
(A) Thaak kɔrth anali̱thi̱th duŋ ɣɛkprɛciɔn lɛbel duŋ OXPHOS kɔmpi̱lɛk. Käp prötieni̱ kärɔ̱ kɛ P<0.05 kä juɔkni̱ 8 (dup-rɛw ANOVA). Dotted line: Thiɛlɛ mi̱ ca riali̱kä mi̱ pa̱a̱rkɛ jɛ kɛ CTRL. (B) Caam: Ɛ cäät duŋ thɛrɛbellar thɛkcin min ca lɛbeli̱d kɛ anti̱-MTCO1 ani̱buɔdi̱ (i̱thkiɛl bar, 20 μm). Kä gua̱a̱th in ca käp ɛ Purkinje thëll pua̱nyni̱ ɛ mi̱ ca kum ɛ mi̱ tɔ̱c. Cuec: Kuanti̱pi̱këcin duŋ MTCO1 lɛbeli̱ (duɔ̱ɔ̱p-kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱; n = 7 ɛ wä kä 20 thëlli̱ anali̱thi̱th kä kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ diɔ̱k). (C) qPCR anali̱thi̱th duŋ mtDNA kɔpi̱ nämbär rɛy kä min ca thɛm kä PN (duɔ̱ɔ̱p-kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱; n = 3 ɛ wä kä 7 kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱). (D) Caam: Ɛ cäät duŋ cerebellar i̱thla̱th mi̱ ca lɛbeli̱d kɛ anti̱-DNA ani̱buɔdi̱ (i̱thkiɛl bar, 20 μm). Kä gua̱a̱th in ca käp ɛ Purkinje thëll pua̱nyni̱ ɛ mi̱ ca kum ɛ mi̱ tɔ̱c. Cuec: Kuanti̱pi̱këcin duŋ mtDNA leciɔni̱ (duɔ̱ɔ̱p-kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱; n = 5 ɛ wä kä 9 thëlli̱ kä kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ diɔ̱k). (E) Ɛ cäät duŋ akuut thɛrɛbellar thɛkcin min nyoth mai̱töYFP + Purkinje thëlli̱ (arröw) rɛy thëll-kɛliw patch klamp ri̱kɔrdiŋ. (F) Kuanti̱pi̱këcin duŋ IV kurb. (G) Rekɔrdiŋni̱ ti̱ cuŋ kɛ kui̱ depölari̱dhiŋ kärɛnt injɛkciɔn rɛy CTRL kɛnɛ Mfn2cKO Purkinje thëlli̱. Top trace: Ɛn pulth in nhiam in ci̱ AP nööŋ. Kä min te pinydɛ: Makdhi̱ma̱m AP prekuɛnci̱. (H) Kuanti̱pi̱këcin duŋ pöththai̱naptik i̱thpɔntaneöth inputni̱ (sPSPni̱). Kä min cuŋ kɛ kui̱ ri̱kɔrdiŋ trace kɛnɛ zuum rɛci̱ödɛ cua kɛ nyoth rɛy (I). Duɔ̱ɔ̱p-kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱ anali̱thi̱th n = 5 ɛ wä kä 20 thëlli̱ kä kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ diɔ̱k. Data ni̱ cua kɛ lat cie mi̱n±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Reprethetib traceni̱ duŋ i̱thpɔntaneöth AP min ca ri̱kɔrdi̱d kɛ la̱tdɛ kɛɛ perpörated patch klamp mödɛl. Top trace: Makdhi̱ma̱m AP prekuɛnci̱. Kä min te pinydɛ: zuum duŋ AP kɛl. (K) Kuanti̱pi̱e̱th ɛ aberig kɛnɛ makdhi̱ma̱m AP prekuɛnci̱ kɛ min ca lar ɛ (J). Mann-Wi̱tni̱ thëm; n = 5 thëlli̱ cua kɛ die̱l guäc kä kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ da̱ŋ ŋuaan. Data ni̱ cua kɛ lat cie mi̱n±SEM; /Cɛ gɔaa.
Ɛn OXPHOS ëë ci̱ ji̱ääk ɛ jɔc cua jiek rɛy Mfn2cKO PN ëë ci̱ runkɛ cop kä juɔkni̱-8, cuɛ nyoth ɛn ɣöö la̱t pi̱thi̱ölöji̱kal duŋ nio̱rɔni̱ ɛ mi̱ /ci̱ rɔ lot ɛlɔ̱ŋ. Kɛ kui̱c ɛmɔ, cua kɔ anali̱thi̱th kɛ ta̱a̱ elɛkti̱rik mi̱ pa̱thi̱b duŋ OXPHOS-depi̱ciɛn nio̱rɔni̱ kä juɔkni̱ 4 ɛ wä kä 5 kɛnɛ juɔkni̱ 7 ɛ wä kä 8 kɛ la̱tdɛ kɛɛ thëll-kɛl patch klamp ri̱kɔrdiŋni̱ rɛy akuut cerebellar i̱thla̱thi̱thni̱ (Pi̱guur 2E). Ɛ /ka̱nɛ lip, ɛn aberig min ci̱ lɔ̱ŋ kä membran buɔ̱mdɛ kɛnɛ input redhi̱tan duŋ Mfn2cKO nio̱rɔni̱ cukɛ ca̱a̱t kɛ kɔnti̱röl, cieŋni̱ mëë cuɛ tekɛ dääk mi̱ tɔt kam thëlli̱ (Table 1). Päärɛ, kä juɔkni̱ 4 ɛ wä kä 5 kɛ run, cuɛ thiɛl mi̱ cua ŋa̱c mi̱ ci̱ rɔ gɛr rɛy kärɛnt-böltɛj ri̱lɛciɔn (IV kurb) cua jiek (Pi̱guur 2F). Cieŋni̱ min, thiɛlɛ Mfn2cKO nio̱rɔni̱ ti̱ ci̱ runkɛ kä juɔkni̱ 7 ɛ wä kä 8 ti̱ ci̱ kään kä IV regi̱mɛn (ɣai̱perpölaraidhɛciɔn ka̱a̱th), cuɛ nyoth i̱ tëkɛ mi̱ jɔc kä ɣai̱perpölaraidhɛciɔn buɔ̱mdɛ rɛy gua̱th in jɔak ɛmɛ. Mi̱ gua̱c, rɛy Mfn2cKO nio̱rɔni̱, ɛn depölari̱dhiŋ karɛnt min no̱o̱ŋ ɣöö bi̱ rɔ nyɔk kɛ loc thi̱n (AP) min bä raar la kɛn ɛ rut ɛ gɔaa, nyoothɛ jɛ ɛn ɣöö min bä raar rɛydiɛn kɛɛliw /cɛ tekɛ dääk mi̱ di̱i̱t kɛ tin la kɔnti̱röl nio̱rɔni̱ tin ci̱ dɔŋ kɛ juɔkni̱ 8 (Table 1 kɛnɛ Thurɛ 2G). Päärkɛ, ɛn locdɛ kɛnɛ ampli̱ti̱öd duŋ i̱thpɔntaneöth pöththi̱naptik karɛnt (sPSCs) cua kɛ pa̱a̱r kɛ tin tekä buɔ̱n kɔnti̱röl, kɛnɛ ɣöö ɛn locdɛ rɔ cuɛ rɔ rep ɛ tuɔɔk ni̱ kä juɔkni̱ 4 ɛ wä kä juɔkni̱ 5 ɛ wä kä juɔkni̱ 7 ɛ wä kä juɔkni̱ 8 kɛ rëp mi̱ cäät (Pi̱guur 2, H kɛnɛ I). Kä gua̱th in ci̱ thi̱naptik maturɛciɔn rɛy PNni̱ (25). Kä tëë ci̱ ben raar ti̱ cäät cua kɛ jiek kɛ kɔr kä mëë ca PNni̱ patchni̱ perpörated. Kɔnpi̱e̱gi̱rɛciɔn ɛmɛ gaŋɛ min de rɔ lot kɛ luäk thëllular ATP min ci̱ ji̱ääk, cie min dɔ̱ŋ bɛ tuɔɔk rɛy thëll-kɛliw patch klamp ri̱kɔrdiŋ. Rɛydɛ kärɔa, ɛn rethting membi̱ran buɔ̱mdɛ kɛnɛ i̱thpɔntaneöth pi̱riŋ prekuɛnci̱ duŋ Mfn2cKO nio̱rɔni̱ /ka̱nɛ ya̱r (Pi̱guur 2, J kɛnɛ K). Rɛy ŋaknɔmä, kɛn tin ci̱ ben raar cua nyoth i̱ PNni̱ tin tekɛ OXPHOS mi̱ jɔc mi̱ /ci̱ lät ɛ gɔaa de kɛn rɔ̱ luäŋ kɛ pɛ̈th kɛ min la tuɔɔk kä di̱t, cuɛ nyoth i̱ tëkɛ kɔmpi̱ɛnthecin mekani̱dhi̱öm min jak kɛ kä rɔmkɛ ni̱ thi̱ääk-nɔrmal elektröpi̱i̱thi̱ölöji̱kal ri̱thpɔnthni̱.
Data ni̱ cua kɛ lat cie mi̱n ± SEM (duɔ̱ɔ̱p-kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱, Ɣo̱lm-Thidak'ä thëm pääri̱ ti̱ ŋuan; *P<0.05). Kä nämbär yunitdä ca nyoth ɛ brakɛtni̱.
Cu nɛy ɛ la̱th lät kɛ gör ŋäcädɛ mi̱ ɛni̱ kategöri̱ rɛy prötieömikni̱ datathɛt (Pi̱guur 1G) cu määni̱ dup tin bi̱ OXPHOS mi̱ dak ɛlɔ̱ŋ gaŋ, kɛ kui̱c ɛmɔ cua lat i̱ ɛŋu min ci̱ PN ya̱r bɛ rɔmni̱ thi̱ääk-nɔrmal elektröpi̱i̱thi̱ölöji̱ (Pi̱guur 2, E ɛ wä kä K). . Pröti̱o̱mikni̱ anali̱thi̱th cuɛ nyoth i̱ endhɛmni̱ tin te rɛy kataböli̱dhi̱öm duŋ kaar cɛɛn aminö athi̱dni̱ (BCAA) cukɛ tekɛ luɔt mi̱ di̱i̱t mi̱ ca riali̱kä-ɛ wä nhial (Pi̱guur 3A kɛnɛ Pi̱guur S5A), kɛnɛ ɣöö min ca nööŋ kɛ jɔak acëtil-CoA (CoA) kiɛ thukthi̱ni̱l CoA bɛ trai̱karbökthai̱lɛtni̱ mat rɛy arteriöthkleröthi̱th (Pi̱guur 3A). Cu nɛy ɛ jiek ɛn ɣöö min te rɛy BCAA tra̱ni̱thaminathe 1 (BCAT1) kɛnɛ BCAT2 kɛn da̱ŋ rɛw cukɛ rɔ̱ re̱p. Kɛn cu kɛn ka̱a̱th in nhiam kä BCAA kataböli̱dhi̱öm katalaidhed kɛ no̱o̱ŋdiɛn kɛ glutamate mi̱ bä kä α-ketöglutarate (26). Tha̱buni̱ti̱ni̱ diaal tin la̱tkɛ kaar cɛɛn ketö athi̱d deɣai̱dröjenathe (BCKD) kɔmpi̱lɛk kɛn cua kɛ rep (kä kɔmpi̱lɛk katalai̱dhi̱th min guur jɛ kɛnɛ min /ca rɔ luɔc kä dekarbökthai̱lɛciɔn min bi̱ ben raar kä BCAA karbön i̱thkeletɔn) (Pi̱guur 3A kɛnɛ Pi̱guur S5A). Cieŋni̱ min, cuɛ thiɛl mi̱ cua ŋa̱c mi̱ ci̱ rɔ gɛr rɛy BCAA kärɔa cua jiek rɛy PN ëë ca kuany, min dɔ̱ŋ bɛ tuɔɔk kɛ rëp thëllular min naŋkɛ kä aminö athi̱dni̱ ti̱ti̱ tin gɔw kiɛ la̱tdɛ kɛ gua̱th kɔ̱kiɛn (glukööth kiɛ laktik athi̱d) kɛ rëp TCA thärkäl (Pi̱guur S5B). PNni̱ tin thiɛl OXPHOS bä cuɛ nyoth i̱ glutamine cuɛ rɔ rep kɛ däk piny kɛnɛ lät tra̱ni̱thaminaciɔn kɛ kɔr juɔkni̱ 8, min dɔ̱ŋ bɛ cu jɔɔc ɛ la mi̱ ca rep-regulɛciɔn duŋ mai̱tökɔndi̱rial endhɛmni̱ glutaminathe (GLS) kɛnɛ glutamine pai̱rubat tra̱ni̱thaminathe 2 (GPT2) (Pi̱guur 3, A kɛnɛ C). Jɛn gɔaɛ ɛn ɣöö ba ŋa̱c ɛn ɣöö min ca la̱th nhial-kä GLS ɛ mi̱ tekɛ guut kä i̱thpli̱ced ai̱thöpuɔm glutaminathe C (GLS-GAC) (kä min ci̱ rɔ gɛr kä Mfn2cKO/CTRL ɛ mi̱ thi̱ääk kɛ 4.5-ni̱ kärɔa, P = 0.05), kɛnɛ ɣöö min ca la̱th nhial-min ca lɛy rɛy ka̱nthɛr ti̱cuthni̱ De luäk mai̱tönergi̱o̱ndi̱rial. (27).
(A) Kä lëth map nyothɛ min ci̱ rɔ ri̱t rɛy prötien lɛbel kɛ kui̱ duɔ̱p in ca lɛy rɛy juɔkni̱ 8. (B) Cäät duŋ cerebellar i̱thla̱th mi̱ ca lɛbeli̱d kɛ anti̱-PCx ani̱buɔdi̱ (i̱thkiɛl bar, 20 μm). Kä arröw mi̱ tɔ̱c nyothɛ ni̱ puɔ̱ny thëll Purkinje. (C) Gua̱th in ci̱ prötien latdɛ anali̱thi̱th cua ŋa̱c cie mi̱ ɛ kandi̱dɛt mi̱ gɔa kɛ kui̱ athɛröthkɛlɛröthith (t-thɛm mi̱ ŋuan, *FDR <5%; n = 3-5 kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱). (D) Nhial: Ɛ i̱thkiɛmatik diagram mi̱ nyoth dup ti̱ gööl tin wä rɛy karbönä min ca lɛbeli̱ min te rɛy [1-13C]pai̱rubɛt tracer (c.d., kɛ rɛy PDH kiɛ tra̱ni̱th-arterial duɔ̱p). Piny: Kä bai̱lin chart nyothɛ perthäntig duŋ thi̱ŋgil-lɛbeli̱d karbön (M1) min ca rɔ ri̱t ɛ la athpa̱rtik athi̱d, thi̱trik athi̱d kɛnɛ malik athi̱d kɛ kɔr kä mëë ca akuut cerebellar i̱thla̱thni̱ lɛbeli̱d kɛ [1-13C]pairubɛt (paired t-thɛm; ** P <0.01). (E) Kɔmprehenthib thaak lɛ̈ɛ̈ŋ anali̱thi̱th duŋ duɔ̱p in ca nyoth. Kä prötieni̱ kärɔ̱ kɛ P<0.05 rɛy juɔkni̱ 8. Da̱thɛd lany: thiɛlɛ ba̱li̱ö mi̱ ca riali̱kä (dup-rɛw anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱; * P <0.05; *** P <0.001). Data ni̱ cua kɛ lat cie mi̱n±SEM.
Rɛy anali̱thi̱th ëëdan, BCAA kataböli̱dhi̱öm cuɛ ben ɛ la kɛl kä tin di̱t tin wä nhial-regulɛciɔn pathwayni̱. Ɛn thuɔ̱k ɛmɛ nyoothɛ jɛ ɛ bum ɛn ɣöö ɛn benti̱lɛciɔn bɔli̱öm in wä rɛy TCA thärkäl dɔ̱ŋ bɛ rɔ gɛr rɛy PN min thiɛl OXPHOS. Nɛmɛ dɔ̱ŋ bɛ cu cuɔ̱ŋ ɛ la ta̱a̱ mi̱ di̱i̱t kä nio̱rɔnal metɛbölik rewiriŋ, min dɔ̱ŋ bɛ tekɛ mi̱ bɛ ya̱r kä nio̱rɔnal pi̱thi̱ölöji̱ kɛnɛ kään rɛy gua̱th ëë rɔm OXPHOS thi̱n mi̱ bɛc bɛc. Ɛ wä kɛɛl kɛ ɣai̱pöthethi̱th ɛmɛ, cua jiek ɛn min di̱tni̱ jɛn kä anti̱-athɛröthkɛlɛrötik endhɛm PCx ɛ mi̱ ca rep-rɛgulɛted (Mfn2cKO/CTRL la gɛɛrɛ rɔ ɛ thi̱a̱k kɛɛ 1.5 gua̱thni̱; Thurɛ 3A), min ca katalai̱dhi̱th min gɛɛr pai̱rubat ɛ wä kä ɣɔkdha̱löacetat (28), min ŋa̱thkɛ i̱ te rɛy brai̱thti̱rötai̱ (28). 30). Mi̱ wä kɛɛl kɛ min ci̱ ben raar kä prötieömikni̱, kɔnpökal mai̱kröthkɔɔpi̱ cuɛ nyoth i̱ PCx cuɛ jɔɔc ɛ la mi̱ ca lɛy kɛnɛ ɣöö cuɛ rɔ rep ɛ lɔ̱ŋ rɛy OXPHOS-depi̱ciɛn PNni̱, niɛ gua̱a̱ mɔ PCx riakti̱bi̱ti̱ cuɛ di̱t ɛlɔ̱ŋ mi̱ cu gaŋ kä Bergmann glial thëlli̱ tin thi̱ääk kɛ kɔnti̱röl (Pi̱guur 3B). Mi̱ görkɛ ɣöö ba thɛm kɛ la̱tdɛ min ca guic ɛ la upregulɛciɔn duŋ PCx, cua akuut cerebellar i̱thla̱thi̱thni̱ jakä gɔw kɛ [1-13C] pai̱rubɛt trathɛr. Mi̱ ci̱ pai̱rubɛt ɣɔkthai̱d ɛ pai̱rubɛt deɣaidröjenathe (PDH), ɛn ai̱thötɔp lɛbeldɛ cuɛ bath, Duŋni̱ ɣöö cua mat rɛy TCA thärkäl intɛrmediëtni̱ mi̱ ci̱ pai̱rubɛt rɔ gɛr ɛ ba̱thkular riakciɔn (Pi̱guur 3D). Rɛy luäkä data ni̱ prötieömikni̱ kɔn, cua guic ɛ la nämbär mi̱ di̱i̱t kä markɛri̱ ti̱ bä kä tracer ɛmɛ rɛy athpa̱rtik athi̱d duŋ Mfn2cKO i̱thlai̱thni̱, niɛ gua̱a̱ mɔ thi̱trik athi̱d kɛnɛ malik athi̱d bä cukɛ tekɛ mödɛrɛt trɛnd, cieŋni̱ min /cɛ tekɛ luɔt (Pi̱guur 3D).
Rɛy dɔpamin nio̱rɔni̱ nyin MitöPark kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱r kɛ mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn min nööŋkɛ ɛ dɔpamin nio̱rɔni̱ ɛ la mi̱ ci̱ mai̱tökɔndi̱rial tra̱ni̱thkri̱pciɔn paktɔr A ji̱i̱n (Tfam) (Pi̱guur S6B) ya̱r (Pi̱guur S6B), PCx ëë ca nyoth bä cuɛ tekɛ luɔt mi̱ di̱i̱t mi̱ ca rep-regulɛted (31), cuɛ nyoth i̱ acëtɔn athi̱d ɣɔ̱kurɛnthkɛrthi̱th duŋ di̱thɛrgulɛthith OXPHOS rɛy pua̱a̱ny. Jɛn ɛ mi̱ gɔaa kɛ ŋäcdɛ ɛn ɣöö jɛn cua jiek ɛn endhɛmni̱ ti̱ gööl (32-34) min dɔ̱ŋ bɛ cu jɔɔc rɛy nio̱rɔni̱ min dɔ̱ŋ bɛ thi̱ëëk kɛ arteriöthkɛlɛröthith kɛn cua kɛ riali̱kä-ɛ wä nhial rɛy PNni̱ tin thiɛl rɛy OXPHOS, ce̱tkɛ mi̱ cie pröpiöni̱l-CoA karbökthi̱lathe (PCC-A), Malöni̱l-Coa mi̱töci̱liönal-CoA mi̱ gɛɛr pröpiöni̱l-CoA mai̱töciönal-A endhɛm 3 (ME3), min lätdɛ min di̱tni̱ jɛn ɛ ɣöö bɛ pai̱rubɛt jiek kä malate (Pi̱guur 3, A kɛnɛ C) (33, 35). Ɛ nyɔk bä, cua jiek ɛn ɣöö ci̱ Pdk3 endhɛm rɔ rep ɛlɔ̱ŋ, min pöthpöri̱lɛtni̱ kɛnɛ ɣöö bɛ PDH jakä lät (36), niɛ gua̱a̱ mɔ cuɛ thiɛl mi̱ ci̱ rɔ gɛr rɛy Pdp1 endhɛm min jak PDH kä lät kiɛ PDH endhɛm kɔmpi̱lɛk kärɔa (Pi̱guur 3A). Ɛ ŋotdɛ, rɛy Mern2cKO PNni̱, ɛn pöthpöri̱lɛciɔn duŋ α1 tha̱buni̱t α (PDHE1α) tha̱buni̱t duŋ pai̱rubɛt deɣai̱dröjenathe E1 kɔmpönɛnt duŋ PDH kɔmpi̱lɛk rɛy Ser293 (ŋa̱c kɛ jɛ i̱ gaŋɛ lät endhɛm duŋ PDH) cua jakä di̱t (Pi̱guur S6C) (Pi̱guur S6C). Pai̱rubɛt /thiɛlɛ jɛ gua̱a̱th mi̱ bɛ wɔ̱ thi̱n.
Kɛ jɔakdɛ, cua jiek ɛn thuper pathway duŋ therin kɛnɛ glai̱thin baöthänthethi̱th, kä min thi̱ääk kɛ mai̱tökɔndi̱rial pölɛt (1C) thärkäl kɛnɛ prölain baöthänthethi̱th (Pi̱guur 1G kɛnɛ Pi̱guur S5C) kɛn kɛndiaal cukɛ tekɛ luɔt mi̱ di̱i̱t-regulɛted, kɛ mëë ca lar ɛ lääri̱, rɛy gua̱th ëë lät kɛn ɛ. Kä ticiuni̱ tin caa göl piny kɛn lätkɛ kɛɛ mai̱tökɔndi̱rial mi̱ /ci̱ lät ɛ gɔaa (5-7). Kɔnpökal anali̱thi̱th min luäk prötieömikni̱ data ni̱ ti̱ti̱ cuɛ nyoth i̱ rɛy PN kɛ OXPHOS mi̱ ci̱ bath, cerebellar thɛlɛthni̱ nyin kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ ti̱ tekɛ juɔkni̱-8 cua kɛ la̱th kä therin ɣai̱drökthi̱metiltra̱ni̱thperɛth 2 (SHMT2), ɛ endhɛm in di̱i̱t kä mai̱tökɔndi̱rial pölɛt thärkäl. Immi̱o̱n ri̱thpɔn mi̱ gɔa (Pi̱guur S5D). Rɛy 13 CU-glukööth-inkubɛted akuut thɛrɛbellar i̱thlai̱thni̱, metɛbölik traciŋ ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ cuɛ räth ni̱ kä ɣöö cuɛ rep-regulɛciɔn duŋ thi̱rin kɛnɛ prölain baöthänthethi̱th, cuɛ nyoth i̱ jɛn ja̱l karbön ai̱thöpuɔmni̱ rɛy thi̱rin kɛnɛ prölain cuɛ rɔ rep (Pi̱guur S5E). Ni̱ mëë ci̱ riakciɔn ëë ca nööŋ ɛ GLS kɛnɛ GPT2 kɛn kɛ ti̱ tekɛ luäŋ kɛ kui̱ thänthei̱thi̱th duŋ glutamate kä glutamine kɛnɛ tra̱ni̱tha̱minɛciɔn kam glutamate kɛnɛ α-ketöglutarate, upregulɛciɔn diɛn cuɛ nyoth i̱ OXPHOS-depi̱ciɛn nio̱rɔni̱ cuɛ tekɛ rëp mi̱ görkɛ kɛ kui̱ glutamate, Nɛmɛ dɔ̱ŋ bɛ tekɛ luɔt kɛ rɔmdɛ thi̱n kɛ rëp pröthi̱anthethith I̱thtai̱nthethith (Pig. Mi̱ gua̱c kɛ tin ci̱ rɔ̱ gɛr, ɛn prötieömik anali̱thi̱th duŋ cerebellar athtrothai̱teth mi̱ bä kä PN-i̱thpethi̱pik Mfn2cKO kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱r cuɛ nyoth i̱ kɛn dup ti̱ti̱ (cu määni̱ anti̱peröɣɛdatheth diaal) /kän kɛn rɔ̱ gɛr ɛ lɔ̱ŋ rɛy latdädiɛn, kɛ kui̱c ɛmɔ cuɛ nyoth ɛn ɣöö metɛbölik redirection ɛmɛ ɛ thɛlɛktib mi̱ ci̱ PN wä piny (Pig. S6,).
Kɛ guutdɛ, kɛn anali̱thi̱thni̱ ti̱ti̱ cua nyoth i̱ tekɛ dääk mi̱ di̱i̱t kä tɛmpöral ɛkti̱bëcin duŋ dupni̱ metɛbölik ti̱ caa lɛy rɛy PNni̱. Cieŋni̱ min abnɔrmal nio̱rɔnal mai̱tökɔndi̱rial pa̱ŋciɔn bɛ cu nööŋni̱ athɛröthkɛlɛröthith kɛ nhiam kɛnɛ 1C ri̱mödɛliŋ (Pi̱guur 3E kɛnɛ Pi̱guur S5C), kɛnɛ ɣöö määni̱ mi̱ ca mar i̱ bɛ rɔ gɛr rɛy latdä I kɛnɛ IV kɔmpi̱lɛkni̱, kɛn tin gɛɛrɔ̱ rɛy thi̱rin de nöbö thi̱nthethi̱th kɛn kärɔ̱ Jɛn cuɛ ben ɛ la mi̱ jɔc rɛy i̱thta̱ min jɔak. OXPHOS /cɛ lät (Pi̱guur 3E kɛnɛ Thurɛ S5C). Gör kä ti̱ti̱ cuɛ lat i̱ ɛ ta̱a̱ mi̱ guurɔ rɔ min bi̱ i̱thti̱reth-indɔktid mai̱tökɔndi̱rial (1C thärkäl) kɛnɛ thai̱töpla̱thmik (thi̱rin baöthänthethi̱th) ɛ loc ɛ la kɛɛl kɛ rëp athɛröthkɛlɛröthith rɛy TCA thärkäl kɛ riali̱dɛ i̱kä kɛ nio̱rɔnal mɛtaböli̱dhi̱öm.
OXPHOS-depi̱ciɛn PNni̱ tin ci̱ dɔŋ kɛ juɔkni̱ da̱ŋ 8 derɛ lät ti̱ ŋuan-ni̱ ti̱ ŋuan rɔm thi̱n kɛnɛ ɣöö bɛ cu wä kɛ rɛy metɛbölik mi̱ di̱i̱t mi̱ bi̱ rɔ nyɔk kɛ ma̱t kɛ luäk mai̱tökɔndi̱rial mi̱ /ci̱ lät ɛ gɔaa. Jiekdɛ ɛmɛ cuɛ nööŋni̱ mi̱ gɔaa mi̱ de rɔ lot mi̱ määni̱ rɛy gua̱th ɛmɛ, thëlli̱ ti̱ti̱ dɔ̱ŋ bi̱ kɛn therapeutik interbɛnciɔn jiek bä kɛ ja̱nydɛ kiɛ ga̱ŋ neurödejenereciɔn. Jäny. Cu nɛy nɛmɛ riali̱kä kɛ rɛy lätni̱ da̱ŋ rɛw ti̱ cuŋ kärɔ̱. Rɛy ca̱p in nhiam, cua Cre-dipɛndɛnt adenö-aththöciated bai̱ra̱th (AAV) bɛktɔr riali̱kä kɛ kui̱c ɛmɔ MFN2 bɛ cu tekɛ thɛlɛkti̱bi̱li̱ mi̱ ca nyoth rɛy OXPHOS-depi̱ciɛn PNni̱ rɛy bi̱bö (Pi̱guur S7A). Kä AAV enkɔɔdiŋ MFN2 kɛnɛ pluorethɛn ri̱pɔrtɛr ji̱i̱n mCerri̱ (Mfn2-AAV) cua kɛ beri̱pi̱d rɛy pri̱märi̱ nio̱rɔn ka̱lciɛri̱ rɛy bi̱trö, min cuɛ MFN2 jakä ɣöö bɛ rɔ nyoth rɛy Cre-diɛn kɛ ta̱a̱dɛ kɛnɛ ɣöö cuɛ mai̱tökɔndi̱rial mörpölöji̱ kän, kɛ kui̱c ɛmɔ cuɛ nio̱rɔmutɛciɔn gaŋ rɛy MfnKO, E Pi̱guur S7). Kɛ kɔrɛ, cua kɔnɛ la̱t rɛy bi̱bö ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ kɛ i̱thteri̱ötakti̱kali̱ kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛɛ juɔkni̱-8-dɔ̱ŋ Mfn2-AAV ɛ wä kä cerebellar kɔrtɛk duŋ Mfn2cKO kɛnɛ kɔnti̱röl kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱r, kɛnɛ ɣöö cua kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱r mi̱ tekɛ juɔk-12 anali̱thi̱th (Pi̱guur 4A). Kä Mfn2cKO kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ tëë ca riali̱kä cukɛ li̱w (Pi̱guur 1, A kɛnɛ B) (16). Bai̱ral tra̱ni̱thda̱kciɔn rɛy bi̱bö cuɛ ben raar ɛ la thɛlɛktib ɣɛkpreciɔn duŋ PN rɛy tha̱a̱ŋ cerebellar thärkäli̱ (Pi̱guur S7, G kɛnɛ H). Kä injɛkciɔn duŋ kɔnti̱röl AAV cuɛ nyothni̱ mCerry kärɔa (Ctrl-AAV) cuɛ thiɛl mi̱ cuɛ nyoth kä di̱gri̱i̱ duŋ neurödejenerecin rɛy Mfn2cKO leeni̱. Mi̱ gua̱c, ɛn anali̱thi̱th duŋ Mfn2cKOni̱ cua tra̱ni̱thducid kɛ Mfn2-AAV cuɛ nyoth i̱ jɛn tëkɛ mi̱ gaŋkɛ mi̱ di̱i̱t kä PN thëll lɛyɛr (Pi̱guur 4, B kɛnɛ C). Rɛydɛ kärɔa, ɛn nio̱rɔn denthi̱ti̱ cuɛ ce̱tkɛ mi̱ cɛ thia̱k kɛ dääkdiɛn kɛ kɔnti̱röl leeni̱ (Pi̱guur 4, B kɛnɛ C, kɛnɛ Pi̱guur S7, H kɛnɛ I). Kä latdɛ duŋ MFN1 duŋni̱ ɣöö /ciɛɛ MFN2 jɛn cuɛ lät ɛ päär rɛy ga̱ŋ li̱eth nio̱rɔnal (Pi̱guur 4C kɛnɛ Pi̱guur S7, C kɛnɛ F), min nyothɛ jɛ ɛn ɣöö latdɛ duŋ ɣɛktöpik MFN1 bɛ cu lät ɛ gɔaa kɛ rëpdɛ kɛ thiɛl MFN2. Kä anali̱thi̱th mi̱ dɔ̱ŋ kä thi̱ŋgil PN lɛbel cuɛ nyoth i̱ Mfn2-AAV cuɛ alti̱rai̱thtra̱kciɛr duŋ mai̱tökɔndi̱ria luäk ɛlɔ̱ŋ, nɔrmalaidhed mtDNA lɛbeli̱, kɛnɛ ɣöö cuɛ latdɛ min di̱i̱t duŋ anti̱-anjiöjenethi̱th markɛr PCx ​​luɔ̱c jɔk (Pi̱guur 4, C ɛ wä kä E). Guäc in guic kɛ Mfn2cKO kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ tëë ca käp rɛy wec mi̱ ci̱ lɔ̱ŋ cuɛ nyoth i̱ ta̱a̱diɛn kɛnɛ nyuuthni̱ ja̱liɛn (ja̱l S1 ɛ wä kä S3) cukɛ rɔ̱ rep. Rɛy thukädɛ, kɛn ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ ti̱ti̱ cua nyoth i̱ ja̱nydɛ ɛn ɣöö ba MFN2 nyɔk kɛ no̱o̱ŋ rɛy PNni̱ ɛ mi̱ dak ɛlɔ̱ŋ rɛy OXPHOS jɛn ro̱ŋɛ kɛ luɔ̱c mtDNA min ca naŋ kɛnɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ atheröthkɛlɛröthith, kɛ kui̱c ɛmɔ bɛ adhɔn dejenereciɔn kɛnɛ lia̱a̱ nio̱rɔnal gaŋ rɛy bi̱bö.
(A) Ɛ i̱thki̱ɛm mi̱ nyoth ɣɛkpi̱ri̱mɛntal i̱thki̱di̱öl kɛ kui̱ injɛkciɔn AAV enkɔɔdiŋ MFN2 mi̱ ci̱ metɛbölik pathway min ca nyoth ɛ lätdɛ. (B) Reprethetib kɔnpökal pötögra̱pni̱ duŋ cerebellar thɛkcini̱ ti̱ ci̱ dɔŋ kɛ juɔkni̱ 12 cua kɛ naŋ kɛɛ Mfn2cKO kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ kɛ juɔkni̱ 8 kɛnɛ ɣöö cua lɛbeli̱d kɛ anti̱-Kalbindin ani̱buɔdi̱. Cuec: I̱thkiɛliŋ duŋ adhɔn paiberi̱. Kä i̱thkiɛl duŋ adhɔn zuum ɛ 450 kɛnɛ 75 μm. (C) Caam: Kuanti̱pi̱këcin duŋ Purkinje thëll denthi̱ti̱ rɛy AAV tra̱ni̱thda̱kciɔn lɔɔp (AAV+) (duɔ̱ɔ̱p-kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱; n = 3 kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱). Cuec: mtDNA guicɛ anali̱thi̱th rɛy tra̱ni̱thduciɔn PN rɛy juɔk 12 (t-thɛm mi̱ /thiɛl rɛw; n = 6 thëlli̱ kä kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ diɔ̱k). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Reprethetib tra̱ni̱thmi̱ciɔn elɛkti̱rɔn mai̱krögra̱pni̱ duŋ PNni̱ duŋ Mfn2cKO cerebellar thɛkcini̱ tra̱ni̱thmi̱ciɔn kɛ bai̱ral bɛktɔri̱ tin ca nyoth. Kä pi̱nki̱ ma̱thki̱ nyothɛ gua̱a̱th in ca käp ɛ dendri̱teth, kɛnɛ ɣöö ɛn yellow dotted i̱thkuɛr nyothɛ ni̱ zuum min ca ŋun kui̱c cuëëc; n cuŋɛ la ni̱kli̱öth. I̱thkiɛl bar, 1μm. (E) nyothɛ cäät duŋ PCx i̱thtɛniŋ rɛy PN tra̱ni̱thducid rɛy juɔkni̱ 12. I̱thkiɛl bar, 20μm. OE, ɛ latdɛ ɛlɔ̱ŋ; FC, gɛri jɛ.
Kɛ jɔakdɛ, cua kɔnɛ go̱r ɛn min gɔa kä peröɣɛdathe-indɔktid thëll thɔ̱rbaibal rɛy PNni̱ min ci̱ OXPHOS di̱thpa̱ŋciɔn jiek. Cu nɛy mCɛri̱ enkɔɔdiŋ AAV-shRNA (hairpin RNA mi̱ ciɛk) ka̱m raar ɛ la mi̱ targɛt muɔth PCx mRNA (AAV-shPCx), kɛnɛ ɣöö cua bai̱ra̱th tuɔm kiɛ i̱thkra̱mbɛl kɔnti̱röldɛ (AAV-scr) rɛy thɛrɛbellum duŋ Mfn2cKO kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱r. Kä injɛkciɔn cua la̱t rɛy juɔk in ŋuaandiɛn kä run (Pi̱guur 5A) kɛ jiek PCx knɔkdɔwn mi̱ gɔa rɛy gua̱th ëë ci̱ PCx latdɛ rɔ rep (Pi̱guur 3C) kɛnɛ ɣöö cu PN thëll lɛyɛr ŋotdɛ te thi̱n (Pi̱guur 1A). Ɛ mi̱ gɔaa ɛn ɣöö ba ŋa̱c ɛn ɣöö mi̱ ca PCx yuɔr piny (Pi̱guur S8A) bɛ cu nööŋni̱ ɣöö bi̱ PN li̱w kɛ pɛ̈th, min la jɛn kärɔa min ca gaŋ kä juey (Pi̱guur 5, B kɛnɛ C). Rɛy kä ɣöö ba mekani̱dhi̱öm duŋ metɛbölik i̱pɛktni̱ min nööŋkɛ ɛ PCx up-regulɛciɔn ŋa̱c, cua kɔnɛ ŋi̱e̱e̱c kɛ redɔk i̱thta̱th duŋ PNni̱ kɛ kɔr PCx ​​knɔkdɔwn kɛnɛ AAV-mediated optikal baöthɛnthɔr Grx1-roGFP2 cua kɛ nyoth kɛɛl (Pi̱guur S8, B ɛ wä kä D) kɛ thëm gluta̱cinji̱ön duŋ pötöciɛn8 Kä ri̱lɛtib. Kɛ kɔrɛ, cua kɔnɛ la̱t kɛ rɛw-pötɔn pluorethcen lai̱ptaim i̱mëjiŋ mai̱kröthkɔɔpi̱ (FLIM) rɛy akuut ŋithä i̱thlai̱thni̱ duŋ 7-wi̱i̱k-dɔak Mfn2cKO kiɛ kɔnti̱röl littermates kɛ ŋi̱e̱c kä min de rɔ gɛr rɛy thai̱töpla̱thmik redɔk i̱thta̱th kɛ kɔr kä mëë ca FLIM kɔndi̱ciɔni̱ veripi̱këci (Pi̱guur S8, E ɛ wä kä G). Kä anali̱thi̱th cuɛ nyoth i̱ cuɛ rɔ rep ɛ lɔ̱ŋ rɛy ɣɔkdhi̱dɛciɔn wec duŋ thi̱ŋgil Mfn2cKO PNni̱ min thiɛl PCx latdɛ, min tekɛ dääk kɛ kɔnti̱röl nio̱rɔni̱ kiɛ Mfn2cKO PNni̱ latdɛ ni̱ i̱thkra̱mbɛl shRNA kärɔa (Pi̱guur 5, D kɛnɛ E). Mi̱ ci̱ PCx latdɛ wä piny-regulɛted, ɛn perthäntig duŋ Mfn2cKO PNni̱ cuɛ nyothni̱ ɣɔkdhi̱daidhed wec mi̱ di̱i̱t mi̱ ci̱ rɔ rep ɛ läny ni̱ kä diɔ̱k (Pi̱guur 5E), cuɛ nyoth i̱ PCx up-regulɛciɔn cuɛ redɔk kapaci̱ti̱ duŋ degenerɛted nio̱rɔni̱ rɔm thi̱n.
(A) Ɛ i̱thki̱ɛm mi̱ nyoth ɣɛkpi̱ri̱mɛntal i̱thki̱di̱öl kɛ kui̱ injɛkciɔn AAV enkɔɔdiŋ shPCx mi̱ ci̱ metɛbölik pathway min ca nyoth ɛ lätdɛ. (B) Reprethetib kɔnpökal pötögra̱pni̱ nyin cerebellar thɛkcini̱ ti̱ ci̱ dɔŋ kɛ juɔkni̱ 8 rɛy Mfn2cKO kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ ti̱ ca tra̱ni̱thducid kɛnɛ lɛbeli̱d kɛ anti̱-kalthi̱neurin ani̱buɔdi̱ kä juɔkni̱ 4. I̱thkiɛl bar, 450μm. (C) Kuanti̱pi̱këcin duŋ Purkinje thëll denthi̱ti̱ rɛy AAV-tra̱ni̱thduced luɔpni̱ (duɔ̱ɔ̱p-kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱; n = 3 ɛ wä kä 4 kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱). Data ni̱ cua kɛ lat cie mi̱n±SEM; ***P<0.001. (D) Thurɛ FLIM mi̱ cuŋ kɛ kui̱dɛ nyothɛ pek teekä min te kam PN mi̱ tekɛ juɔkni̱-7 mi̱ nyooth glutathiön redɔk thɛnthɛr Grx1-roGFP2 piny kä ɣɛkpi̱ri̱mɛntal kɔndi̱ciɔni̱ tin ca lɛy. LUT (guic-nhial tɛbol) rɛci̱ö: thaak in ci̱ kään (rɛy pi̱köthekɔndi̱ni̱). I̱thkiɛl bar, 25μm. (E) Kä ɣi̱thtögra̱m nyothɛ dääk duŋ Grx1-roGFP2 ba̱liömmi̱ rɛy teekä ɛ jiɛn kä (D) (n=158 ɛ wä kä 368 thëlli̱ rɛy kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ rɛw piny kä kɔndi̱ciɔn kɛl). Kä pie chart min te nhial kä ɣi̱thtögra̱m kɛl: nyothɛ nämbär thëlli̱ tin tekɛ luɔt mi̱ bäär (mi̱ lual, ɣɔkdhi̱daidhed) kiɛ mi̱ ciɛk (mi̱ yie̱l, mi̱ ci̱ kuɛ̈ɛ̈) ba̱liö ni̱ teekä, min läny 1 SD kä aberig tëk ba̱li̱ö rɛy CTRL-AAV-scr. (F) Kä mödɛl ëë ca nööŋ nhial cuɛ nyothni̱ min gaŋkɛ min nööŋkɛ ɛ upregulɛciɔn duŋ nio̱rɔnal PCx.
Kɛn diaal, kɛn data ni̱ tin ca ŋun ɛn wa̱nɛ mɛ nyothɛ jɛ ɛn ɣöö ɛn re-ɛkpreciɔn duŋ MFN2 bɛ PN min ci̱ räth luäk kɛɛliw kɛ dak OXPHOS mi̱ di̱i̱t, mi̱ ci̱ mtDNA kuɛ̈ɛ̈ ɛlɔ̱ŋ, kɛnɛ mi̱ ci̱ abnɔrmal ithta-cie mörpölöji̱ mi̱ di̱i̱t ɛlɔ̱ŋ, kɛ kui̱c ɛmɔ bɛ ŋot kɛ mi̱ wä nhiam määni̱ rɛy jua̱thni̱ tin ci̱ räth. Ni̱o̱rödejenerecin la ŋunɛ ca̱a̱tdɛ mi̱ luɔckɛ rɔ kä i̱thtëj ɛ ŋot thëll /kenɛ ni̱ li̱w. Ɛn di̱gri̱i̱ ɛmɛ kä mɛtɛbölik laa jɛ laa jakɛ kä bum ɛ lua̱ŋ in tä kä nio̱rɔni̱ kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ athɛrɔthkɛlɛrɔthith (ɛ riwiring duŋ TCA thärkäl), min laa PCx laa gaŋɛ rɛy PNni̱ tin /thiɛl OXPHOS kä laa thɛl ɛ jakä li̱w, kɛ kui̱c ɛmɔ laa gaŋɛ naath (Pi̱guur 5F).
Rɛy ŋi̱i̱cä nɛmɛ, cua kɔnɛ nyoth ɛn ɣöö min ca loc ɛ PNni̱ kä OXPHOS di̱thpa̱ŋciɔn ɛ mi̱ la wä ɛ määth ɛ wä kä TCA thärkäl atheröthkɛlɛröthi̱th kɛ rɛy duɔ̱p in lät kɛ dääk min lät ɛ metɛbölik prögi̱ra̱mni̱. Cu nɛy prötieömik anali̱thi̱th kɔnpääm kɛ ca̱a̱p kɔmpi̱lɛmɛnteri̱ ti̱ ŋuan kɛnɛ ɣöö cua nyoth i̱ mi̱ ca ŋak ɛ mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn mi̱ bɛc bɛc, nio̱rɔni̱ tekɛ ta̱a̱ mi̱ kueckɛ ni̱ wal mi̱ la metɛbölik elathtikthi̱ti̱. Kɛ ga̱a̱cdan kɛɛliw, ɛn la̱t in laa nyɔk kɛ lätni̱ kɛɛliw /cɛ lot ni̱ ɣöö bɛ ku lɛ tä kɛ terminal metɛbölik wec in laa wɔ̱ kɛɛl kɛ nio̱rɔdejenerecin ɛ määth kä /cɛ rɔ dee luäŋ kɛ luny jɔk, duŋdɛ ɣöö data ni̱ kɔn laarɛjɛ ɛn ɣöö dɔ̱ŋ bɛ ku lɛ tä kɛ min laa rɔmkɛ nio̱rɔn thi̱n amäni̱ gua̱a̱th in /ken thëll ni̱ li̱w. Gör kä nɛmɛ nyothɛ jɛ ɛn ɣöö nio̱rɔni̱ tekɛ di̱gri̱i̱ mi̱ di̱i̱t kä mɛtabölik pla̱thtikthi̱ti̱ rɛy pua̱a̱ny. Ɛn thuɔ̱k ɛmɛ nyoothɛ jɛ ɛn ɣöö mi̱ caa MFN2 nyɔk kɛ no̱o̱ŋ kɛ kɔrɛ bɛ ku lɛ wɔ̱ ɛ la mi̱ caa nyoth ɛ key metɛbölik markɛri̱ kä bɛ PN ku lɛ gaŋ kä ɣöö bɛ ku lɛ wɔ̱. Kä min gua̱c, jɛn la athɛröthkɛlɛröthith ɛ gaŋ kä bɛ närbäthni̱ jakä pɛ̈th. tra̱ni̱ththɛkcuɔl.
Kɛl kä tin ca jiek ɛ gɔaa ɛlɔ̱ŋ rɛy ri̱thääcä dan ɛ jɛn ɣöö PNni̱ tin thiɛl OXPHOS de kɛn TCA thärkäl mëtaböli̱dhi̱öm riali̱kä ɛ la ɣöö ba endhɛmni̱ jakä wä nhial min la arteriöthkɛlɛröthith ɛ jakä lät. Mɛtabölik ri̱arrɛnji̱mɛn ɛ mi̱ ŋa̱ckɛ kä thëlli̱ ka̱nthɛrä, tha̱a̱ŋkiɛn cukɛ tekä glutamine kɛ rëp TCA thärkäl intɛrmediëtni̱ kɛ no̱o̱ŋdiɛn kɛ ekui̱bɛlɛntni̱ ti̱ kuiy, min no̱o̱ŋ rɛthpi̱rɛtɔri̱ cɛɛn kɛnɛ ɣöö bɛ lipid kɛnɛ ni̱kli̱ötaid baöthänthethi̱th prekurthɛri̱ rɔm thi̱n (39, 40). Ɛn ŋi̱i̱c ëë pay la̱t cuɛ nyoth ɛn ɣöö rɛy peri̱peral ti̱cuni̱ tin ci̱ OXPHOS lät ɛ gɔaa, ɛn glutamine/glutamate metɛböli̱dhi̱öm ɛ mi̱ ca ŋa̱c ɛlɔ̱ŋ bä (5, 41), gua̱th in bi̱ duɔ̱ɔ̱p in wä glutamine rɛy TCA thärkäl kulɛ tekä ɣöö ci̱ OXPHOS bɛc ɛlɔ̱ŋ (41). ). Cieŋni̱ min, cuɛ thiɛl mi̱ nyoothɛ ɛ jɔc kä ɛni̱ mi̱ cäät kä nio̱rɔnal metɛbölik pla̱thtikthi̱ti̱ rɛy pua̱a̱ny kɛnɛ min de rɔ lot kɛ ta̱a̱dɛ rɛy jua̱thni̱. Rɛy ŋi̱i̱cä mi̱ thi̱a̱k rɛy bi̱trö, pri̱märi̱ kɔrti̱kal nio̱rɔni̱ cua kɛ nyoth i̱ kɛn glutamate puɔɔli̱ kɛ kui̱ nio̱rɔtra̱ni̱thmi̱ciɔn, kɛ kui̱c ɛmɔ bɛ ɣɔkdhi̱dɛtip mëtaböli̱dhi̱öm kɛnɛ athɛröthkɛlɛröthith jakä wä nhial rɛy gua̱th mi̱ tekɛ mëtabölik i̱thti̱rɛth (42). Jɛn gɔaɛ ɛn ɣöö ba ŋa̱c i̱ piny pa̱rmakölöji̱kal ini̱bi̱ciɔn duŋ TCA thärkäl endhɛm thukcinat deɣai̱dröjenathe, pai̱rubat karbökthai̱lɛciɔn cua ŋäth i̱ rɔmni̱ thänthei̱thith duŋ ɣɔkdha̱löathetat rɛy ka̱lciɛr thɛrɛbellar granul nio̱rɔni̱ (34). Cieŋni̱ min, ɛn pi̱thi̱ölöji̱kal relebanthi̱ duŋ mekani̱dhi̱ömni̱ ti̱ti̱ kä ŋith ti̱cu (gua̱a̱th in bi̱ athɛröthkɛlɛröthith ŋäth i̱ jɛn di̱tdɛ kä athtrothai̱teth) cuɛ ŋot kɛ mi̱ tekɛ luɔt mi̱ di̱i̱t kä pi̱thi̱ölöji̱kal (43). Rɛy kä nɛmɛ, data ni̱ kɔn nyothɛ jɛ ɛn ɣöö PNni̱ tin ca ya̱r ɛ OXPHOS rɛy pua̱a̱ny dɔ̱ŋ bi̱ kɛ rɔ̱ ri̱t ɛ la BCAA degradɛciɔn kɛnɛ pai̱rubat karbökthi̱lɛciɔn, min la kɛn rɛw tin di̱t tin nööŋkɛ thupplemɛntecin duŋ TCA puɔɔl intɛrmediëtni̱. Cieŋni̱ min cua guic i̱ jɛn luäk duŋ BCAA kataböli̱dhi̱öm kä nio̱rɔnal enerji̱ mëtaböli̱dhi̱öm cua nööŋ nhial, rɛydɛ matdɛ ni̱ la̱t glutamate kɛnɛ GABA kɛ kui̱ nio̱rɔtra̱ni̱thmi̱ciɔn (44), cuɛ ŋot thiɛlɛ mi̱ nyoothɛ ɛn mekani̱dhi̱ömni̱ ti̱ti̱ rɛy bi̱bö. Kɛ kui̱c ɛmɔ, jɛn cuɛ thia̱k kɛ lat i̱ di̱thpa̱ŋcinal PNni̱ bɛ rɔ luäŋ kɛ luäk kɛ min ca naŋ ɛ TCA intermediëtni̱ min nööŋkɛ ɛ aththi̱mi̱lɛciɔn prötheth ɛ rëp athɛröthkɛlɛröthith. Rɛydɛ kärɔa, upregulɛciɔn duŋ PCx dɔ̱ŋ bɛ go̱ri̱ ɣöö bɛ rɔmni̱ rëp görä kɛ kui̱ athpartik athi̱d, min cua nyoth rɛy pröli̱perɛtiŋ thëlli̱ kɛ mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn (45). Cieŋni̱ min, metabölömikni̱ anali̱thi̱th ëëdan cuɛ thiɛl mi̱ cuɛ nyoth mi̱ ci̱ rɔ gɛr rɛy i̱thtëdi̱-i̱thtët lɛbel duŋ athpartik athi̱d rɛy Mfn2cKO PNni̱ (Pi̱guur S6A), min cua guic i̱ nyoothɛ ta̱a̱ metɛbölik mi̱ göl kä lät athpartik athi̱d kam pröli̱perɛtiŋ thëlli̱ kɛnɛ pöth-mai̱tötik nio̱rɔni̱. Cieŋni̱ min mekani̱dhi̱öm in thuɔ̱k duŋ PCx upregulɛciɔn rɛy di̱thpa̱ŋcinal nio̱rɔni̱ rɛy bi̱bö cuɛ ŋot ɛ la mi̱ ca ciɛŋkɛ, cua nyoth ɛn ɣöö min ci̱ ben raar ɛ ŋot /kenɛ ni̱ cop tëkɛ luäŋ mi̱ di̱i̱t rɛy rɔmä redɔk wec duŋ nio̱rɔni̱ thi̱n, min cua nyoth rɛy FLIM ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ kä cerebellar i̱thlai̱thni̱. Rɛydɛ kärɔa, ga̱ŋ PNni̱ kä ɣöö bɛ PCx jakä wä nhial bɛ cu nööŋni̱ ɣɔkdhi̱daidhed wec mi̱ di̱i̱t kɛnɛ ɣöö bɛ thëll jakä li̱w kɛ pɛ̈th. Kä lät BCAA degradɛciɔn kɛnɛ karbökthai̱lɛciɔn duŋ pai̱rubɛt /ci̱kɛ dup ti̱ nyooth ciɛŋ peri̱peral ti̱cuthni̱ nyin mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn (7). Kɛ kui̱c ɛmɔ, kɛn cukɛ ce̱tkɛ mi̱ kɛn kɛ ti̱ di̱t kä OXPHOS-depi̱ciɛn nio̱rɔni̱, cieŋni̱ mi̱ /ciɛɛ jɛn kärɔa, min gɔa kɛ kui̱ nio̱rödejenereciɔn. .
Cɛrebellar di̱dhi̱thi̱ ɛ ɣe̱ti̱röji̱niöth ta̱a̱ neurödejenɛratib di̱dhi̱thi̱ min la jɔc ɛ la atadhia kɛnɛ ɣöö ni̱ ciaaŋ la ya̱rɛ PNni̱ (46). Nio̱rɔn puɔ̱pulëcin ɛmɛ ɛ mi̱ la bɛ̈c ɛlɔ̱ŋ kä mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn kɛ ɣöö thɛlɛktib dejenereciɔn diɛn rɛy kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ ɛ mi̱ ro̱ŋ kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ nyin muɔtɔr thi̱mptɔmni̱ ti̱ ŋuan tin nyooth ciɛŋ ran i̱thpinötherebellar atadhia (16, 47, 48). Kɛ mëë ca lar ɛ lääri̱, ɛn tra̱ni̱thjenik muɔth mödɛl kɛ mutant ji̱i̱n ɛ mi̱ thi̱ääk kɛ yuman i̱thpinötherebellar atadhia kɛnɛ ɣöö tëkɛ mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn (49, 50), cuɛ guic ni̱ min gɔa kɛ ŋi̱i̱c kä min bi̱ ben raar kä OXPHOS depi̱ciɛn rɛy PNPH. Kɛ kui̱c ɛmɔ, jɛn cuɛ rɔ lot ɛlɔ̱ŋ kɛ dääkdɛ kɛnɛ ŋi̱i̱cdɛ ɛn nio̱rɔn puɔ̱pulëcin ɛmɛ min rɛlrɔ. Cieŋni̱ min, kɛ min ca ŋun i̱ PNni̱ kɛn cukɛ tekɛ pi̱rɛjɛr mi̱ di̱i̱t kɛnɛ ɣöö cukɛ tekɛ pröpörciɔn mi̱ tɔt kä cerebellar thëll puɔ̱pulëcin kɛɛliw, kɛ kui̱ ŋi̱i̱cni̱ ti̱ ŋuan kä ömikni̱-bɛth, thɛlɛktib theparaciɔn duŋdiɛn cie thëlli̱ diaal cuɛ ŋot ɛ mi̱ bɛc ɛlɔ̱ŋ. Cieŋni̱ min jɛn cuɛ thia̱k kɛ ɣöö /cɛ rɔ bi̱ lot kɛ jiek kä ɣöö thiɛlɛ mi̱ ci̱ rɔ gɛr kä thëlli̱ kɔ̱kiɛn (ɛlɔ̱ŋ ti̱cuni̱ tin di̱t), kɔnɛ matni̱ ka̱a̱th mi̱ gɔa mi̱ ca da̱a̱k kɛ FACS kɛ jiek nämbärä mi̱ ro̱ŋ kä bai̱bɔl nio̱rɔni̱ kɛ kui̱ prötieömikni̱ anali̱thi̱th min te piny, kɛnɛ ɣöö cuɛ tekɛ prötien mi̱ di̱i̱t mi̱ ca kum kä prötieni̱ 3000 (51). Kɛ ga̱ŋ bai̱bili̱ti̱ duŋ thëlli̱ diaal, ɛn ca̱p in thöpnɛ ɛn wa̱nɛ mɛ /cɛ kɔn jakä guic ni̱ min ci̱ rɔ gɛr rɛy dupni̱ mɛtabölik rɛy mai̱tökɔndi̱ria, duŋni̱ ɣöö bä guic min ci̱ rɔ gɛr rɛy thai̱töpla̱thmik kɔuntɛrpartni̱kɛ, min thuɔ̱k kɛ la̱t mai̱tökɔndi̱rial membi̱ran lɛbel rɛy enri̱cimɛn min ca lɛy kä nämbär mi̱thödh thɛl mi̱ ji̱di̱t kä mai̱tökɔndi̱ria. (52, 53). Kä ca̱p in canɛ lat /cɛ thi̱ääk kɛ ŋi̱i̱c Purkinje thëlli̱ kärɔa, duŋni̱ ɣöö dɔ̱ŋ bɛ lät ɛ thia̱k kä ɛni̱ thëll kɛ riali̱ metɛbölik min gɛɛrɔ rɛy ŋithä min tekɛ juey, cu määni̱ mödɛli̱ kɔ̱kiɛn nyin mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn.
Kɛ jɔakdɛ, kɔn cua therapeutik wär-nyiini̱ ŋa̱c rɛy gua̱th ɛmɛ min la metɛbölik ɛ nyɔk kɛ riali̱kä min bi̱ nyuuthni̱ tin di̱t kä thëllular i̱thti̱reth luɔc jɔk kɛɛliw kɛnɛ ɣöö bɛ nio̱rɔnal dejenerecin gaŋ. Kɛ kui̱c ɛmɔ, ŋäc läätdä min bi̱ ben raar kä rewiring min ca lat ɛn wa̱nɛ dɔ̱ŋ bɛ ŋuni̱ ŋäc mi̱ di̱i̱t rɛy kä min de rɔ lot kɛ kui̱ kä ɣöö ba nio̱rɔnal bai̱bili̱ti̱ rɔm thi̱n rɛy gua̱th mi̱ ci̱ mai̱tökɔndi̱rial di̱thpa̱ŋciɔn. Rithääc in bi̱ ben nhiam bɛ go̱ri̱ ɣöö bɛ min gɛɛrɔ rɛy enerji̱ mɛtaböli̱dhi̱öm rɛy thëlli̱ ŋithä kɔ̱kiɛn go̱o̱rɛ ɣöö ba nyoth kɛɛliw ɛn läth ŋuɔ̱tni̱ ti̱ti̱ lät kä jua̱th neurölöji̱kal kɔ̱kiɛn.
MitoPark kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ cua kɛ lat ni̱ wal (31). C57BL/6N kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ kɛ loxP pla̱nkiŋ Mfn2 ji̱i̱ni̱ cua kɛ lat ni̱ wän (18) kɛnɛ ɣöö cua kɛ gɔ̱k kɛ L7-Cre kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ (23). Kä mëë ci̱ ben raar ɛ la ɣe̱ti̱rödhai̱göth pröjeni̱ mi̱ la rɛw cua kɛ ŋok kɛ ɣömödhai̱göth Mfn2lödhP/Mfn2lödhP kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱r kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ Purkinje-i̱thpethi̱pik ji̱i̱n knɔkautni̱ kɛ kui̱ Mfn2 (Mfn2lödhP/Mfn2lödhP; L7-cre). Rɛy thɔ̱bthetdä duŋ matdä, kä Gt (ROSA26) ThɔrTɔ̱p-mi̱tö-YFP allële (thtɔp-mtYFP) cua nööŋ kɛ rɛy ri̱wni̱ ti̱ ca mat thi̱n (20). Lät leeni̱ diaal cua kɛ la̱t kɛ ta̱a̱ in ca ŋun ɛ Yurɔpian, naciɔnal kɛnɛ ini̱thti̱tuciɔnal guidelines kɛnɛ ɣöö cua kɛ apprubi̱d ɛ LandethamtpürNatur duŋ Umwelt kɛnɛ Berbraucherchutz, Nɔth Rhine-Wɛthpalia, Jiɛrmani̱. La̱t leeni̱ bä guɔ̱ɔ̱rkɛ ni̱ ŋuɔ̱t tin caa ka̱m raar ɛ Yurɔpian Pɛdɛrɛciɔn duŋ Laböratöri̱ Thaanyni̱ Leyni̱ Aththöciëcini̱.
Kɛ kɔr kä mëë caa aneththeti̱th la̱th rɛy ciëkdɛ min ruët, ɛn embryo muɔth laa jɛ laa wockɛ (E13). Kä kɔrtɛk cua da̱a̱k rɛy Ɣanki̱th' Balanced Thalt Thɔ̱luciɔn (HBSS) cua mat kɛɛ 10 mM Ɣepeth kɛnɛ ɣöö cua wä kä Dulbekkö'ä Mödi̱paid Eagle'ä Mëdiöm min te papain (20 U/ml) kɛnɛ thi̱thtien (1μg/ml). Inkubɛt ti̱cu rɛy DMEM) kɛnɛ ɣöö ba jɛ da̱a̱k ɛ endhɛmatik dai̱jɛciɔn. Ml) kä 37°C kɛ minitni̱ ti̱ 20, kɛ kɔrɛ cua mekani̱kali̱ mi̱l rɛy DMEM cua mat kɛɛ 10% fetal böbain thi̱ra̱m. Thëlli̱ cua kɛ pith kä gi̱laath kɔberthi̱lipni̱ ti̱ ca kum kɛ pöli̱thi̱n kä denthi̱ti̱ duŋ 2×106 kä 6 cm ka̱lciɛr di̱th kiɛ kä denthi̱ti̱ duŋ 0.5×105 thëlli̱/cm2 kɛ kui̱ i̱mëjiŋ anali̱thi̱th. Kɛ kɔr thaakni̱ da̱ŋ 4, ɛn mëdiöm cua gɛr kɛ Neurobathal thi̱ra̱m-mi̱ thiɛl mëdiöm min tekɛ 1% B27 tha̱pplemɛn kɛnɛ 0.5 mM GlutaMax. Kä nio̱rɔni̱ kɛ kɔrɛ cua kɛ tit kä 37°C kɛnɛ 5% CO2 rɛy ɣɛkpi̱ri̱mɛnä kɛɛliw, kɛnɛ ɣöö cua kɛ moc mi̱th kä kɛɛl rɛy juɔkni̱. Rɛy kä ɣöö ba nyɔk kɛ ma̱t rɛy bi̱trö, 3μl (24-wɛll ka̱lciɛr di̱th) kiɛ 0.5μl (24-wɛll plat) duŋ AAV9 bai̱ra̱th bɛktɔr min guɔ̱r kɛrɔ̱ cua la̱t kɛ jak nio̱rɔni̱ kä gɔw kɛ cäŋ in rɛwdɛ rɛy bi̱trö: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addjin, katalɔg nämbär 105530-AAV9) kɛnɛ AAV9.CMV.HI.eGFP-Kre.WPRE.SV40 (Addjin, katalɔg nämbär 105545-AAV9).
Muɔth Mfn1 kɛnɛ Mfn2 kɔmpi̱lɛmɛntɛri̱ DNA (jiekɛ kä Addgene pla̱thmid #23212 kɛnɛ #23213, kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱) kɛn cua kɛ markɛ kɛ V5 thi̱kuɛnthi̱ (GKPIPNPLLGLDST) kä C-termina̱th, kɛnɛ ɣöö cua kɛ mat kɛɛ mCerri̱ rɛy prɛmä kɛ rɛy T2A thi̱kuɛnthi̱. Grx1-roGFP2 ɛ muc mi̱ bä kä Ɣei̱delberg TP Dick DFKZ (Deuthceth Krebthpuɔrthcuŋthɛntrum). Mi̱ ca tdTɔmatö kathtɛt gɛr kɛ la̱tdɛ kɛɛ kɔnbenciɔnal klɔniŋ methɔdni̱, ɛn kathtɛt cua thɔ̱bklɔn rɛy pAAV-CAG-PLEK-tdTɔmatö jɔkdɛ (Addjen repi̱rɛn nämbär 28306) kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ pAAV-CAG-PLEK-mCɛri̱-T2A-MFNGAV2-VCA5, PLEK-mCɛri̱-T2A-MFN1-V5 kɛnɛ pAAV-CAG-Plɛk-Grx-röGFP2 bɛktɔri̱. Ɛn ca̱p mi̱ cäät cua la̱t kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ kɔnti̱röl bɛktɔr pAAV-CAG-FLEX-mCɛri̱. Rɛy kä ɣöö ba AAV-shPCx kɔni̱thtra̱kt nööŋ, ɛ pla̱thmid AAV bɛktɔr (BektɔrBuildɛr, pAAV [shRNA] -CMV-mCɛri̱-U6-mPcx- [shRNA#1]) jɛn go̱o̱rɛ, min tekɛ DNA thi̱kuɛnthi̱ min enkɔɔdiŋ kä shRNA min targɛtiŋ muɔth PCx (5'CTAGCTAGTTGTGCGACTACTA 3′) Rɛy kɔnti̱röl duŋ U6 prömötɛr, mCherry ɛ mi̱ lät piny kɔnti̱röl duŋ CMV prömötɛr. Kä la̱t audhi̱li̱ɛri̱ AAV bɛktɔri̱ cua la̱t kɛ mëë ca la̱r ɛ ram ëë lätdɛ (Thëll Baölabni̱). Rɛydɛ mi̱ ciɛk, lätdɛ kɛɛ tra̱ni̱thpɛr pla̱thmid min naŋ mCɛri̱-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-PLEK-mCɛri̱-T2A-MFN2-V5), mCɛri̱-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-PLEK-mCɛri̱) tra̱ni̱thiɛnli̱ Tra̱ni̱thpekciɔn duŋ thëll-MFCNV2). (pAAV-CAG-FLEX-mCɛri̱) kiɛ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kɔdiŋ ji̱i̱n, cie mi̱ cie kɔdiŋ AAV1 kapthid prötien kɛnɛ aththethöri̱ prötien Pakɛjiŋ pla̱thmid pla̱thmid, kɛ la̱tdɛ kɛɛ kalthi̱öm pöthpët methɔd. Kä krud bai̱ra̱th thuperna̱tɛn cua jiek ɛ thärkäli̱ ti̱ kɔ̱c-thaw rɛy ɣacä mi̱ ci̱ kööt/ethanöl bath kɛnɛ lai̱th thëlli̱ rɛy pöthpët buppered thalain (PBS). Kä AAV bɛktɔr cua riali̱kä ɛ di̱thkɔntinuöth ai̱ödikthanɔl gi̱rɛdiɛn alti̱rathɛnti̱ri̱pugɛciɔn (thaani̱ 24 kä 32,000 rpm kɛnɛ 4°C) kɛnɛ ɣöö cua kɔncentrated kɛ la̱tdɛ kɛɛ Amikɔn alti̱ra-15 thɛnti̱ri̱pugal pi̱li̱tɛr. Jenɔm tai̱tɛr duŋ AAV1-CAG-PLEK-mCɛri̱-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 jenɔm kɔpi̱ (GC)/ml], AAV1-CAG-PLEK-mCɛri̱ (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-PLEK cua thɛm cie min ca thɛm ɛ la ri̱i̱ldtai̱m). (qPCR)-MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) kɛnɛ AAV1-CAG-Plɛk-Grdhi̱-röGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Pri̱mari̱ nio̱rɔni̱ cua kɛ ŋok rɛy ɣaci̱-kɔld 1x PBS, pelleted, kɛnɛ ɣöö kɛ kɔrɛ cua kɛ ɣömöjeni̱dhed rɛy 0.5% Trai̱tɔn X-100 / 0.5% thɔ̱diöm deɔkthi̱kölɛt/PBS lai̱thi̱th bupper min te pöthpëtheth kɛnɛ prötieath ini̱bi̱tɔr (Roche). Prötien kuanti̱pi̱këcin cua la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ bai̱cinköninik athi̱d aththei̱ (Thermö Pi̱ther Thaanytipik). Kä prötieni̱ kɛ kɔrɛ cua kɛ da̱a̱k ɛ SDS-pöliakrilamide jel elektröpörethi̱th, kɛ kɔrɛ cua kɛ yuɔr piny kä pöli̱bai̱nai̱lideen pluoraid membɛrɛn (GE Ɣelthkɛr). Blɔk nɔ̱n-i̱thpethi̱pik thaytni̱ kɛnɛ inkubɛt kɛ pri̱märi̱ ani̱buɔdi̱ (guic Tɛbɛl S1 kɛ latdɛ kɛɛliw) rɛy 5% cak rɛy TBST (Tri̱th-bappered thalain kɛ Tween), ka̱a̱th lak kɛnɛ thɛkɔnderi̱ ani̱buɔdi̱ rɛy TBST Inkubɛt. Inkubɛt kɛ pri̱märi̱ ani̱buɔdi̱ kɛ wäär kä +4°C. Kɛ kɔr kä mëë ca lak, la̱thni thɛkɔnderi̱ anti̱bo̱di̱ kɛ thaakni̱ da̱ŋ rɛw kä lëth duëël. Kɛ kɔrɛ, ɛ inkubëtiŋ blɔt mi̱ cäät kɛ anti̱-β-aktin ani̱buɔdi̱, ɛn lödiŋ mi̱ cäät cua kɔnpääm. Detekciɔn ɛ gërɛ kä kemi̱luminethcen kɛnɛ rëp kemi̱luminethcen (GE Ɣelthkɛr).
Kä nio̱rɔni̱ tëë ca pith ni̱ wal kä gi̱laath kɔberthi̱lipni̱ cua kɛ yiath piny kɛ 4% parapuɔrmaldeɣaide (PFA)/PBS kä thaak in ca lɛy kä lëth duëël kɛ minitni̱ da̱ŋ 10. Kä kɔberthi̱lipni̱ kɛn cua kɛ kɔn la̱th rɛy 0.1% Tritɔn X-100/PBS kɛ minitni̱ 5 kä lëth duëël, kɛ kɔrɛ cua kɛ gaŋ rɛy bupper [3% böbain thi̱ra̱m albumin (BSA)/PBS]. Kɛ cäŋ in rɛwdɛ, cua kɔbhri̱pni̱ lak kɛ blökiŋ bupper kɛnɛ ɣöö cua kɛ inkubɛted kɛ pluöröpɔr-kɔnjugɛted thɛkɔnderi̱ ani̱buɔdi̱ mi̱ lot rɔ kɛ thaakni̱ 2 kä lëth duëël; kɛ jɔakdɛ, kɛn tha̱mpuɔli̱ cua kɛ lak ɛ gɔaa rɛy PBS kɛ 4′,6-diamidino-2-Peni̱li̱ndöle (DAPI) ɛ mi̱ ca kɔntɛri̱thtɛin kä kɛ kɔrɛ cua kɛ yiath piny kä mai̱kröthkɔɔp i̱thlai̱d kɛ Akua-Pöli̱/Päm.
Kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ (wut kɛnɛ ciek) cua kɛ aneththeti̱d ɛ intraperitönial injɛkciɔn duŋ ketamine (130 mg/kg) kɛnɛ dhai̱ladhin (10 mg/kg) kɛnɛ ɣöö cua kɛ la̱th piny pua̱a̱ny kɛ karpröpen analjɛthik (5 mg/kg), kɛnɛ ɣöö cua kɛ la̱th rɛy i̱thteri̱ötaktik ini̱thtrumɛn (Kopped warmf) ekui̱. Nyuɔ̱thkɛ thok wec kɛnɛ läthdɛ lät kɛ dental drill kɛ jak tha̱a̱ŋ cerebellar kɔrtɛk kä kuiy min wä kɛɛl kɛ cɔ̱w mi̱th (kä lambda: juɔ̱l 1.8, lateral 1, min wä kɛɛl kɛ löbu̱li̱ IV kɛnɛ V). La̱tdɛ thi̱ri̱ŋ mi̱ ca rɔ ri̱t kɛ tiit kɛ ca̱k puɔ̱l mi̱ tɔt rɛy wec kɛ ɣöö /cɛ ba̱thkulaciɛr min te piny bi̱ ya̱r. Kɛ kɔrɛ ɛn gi̱laath kapi̱lli̱ri̱ min ca thur ɛ määth cua la̱th ɛ määth rɛy mai̱krö-ɣo̱l (ɛ tokɛ kä -1.3 ɛ wä kä -1 kä bɛntral tha̱a̱ŋ dura mater), kɛnɛ ɣöö 200 ɛ wä kä 300 nl AAV cua tuɔm rɛy mai̱krö-injɛktɔrä (Narithi̱ge) kɛ manual thi̱ri̱ŋni̱ (Narithi̱ge pi̱riööd duŋ 00 minitni̱ da̱ŋ rɛw. Kɛ kɔr kä mëë ca la̱th rɛy tɔ̱ɔ̱cä, la̱thni̱ kapi̱lli̱ri̱ kɛ minitni̱ da̱ŋ wäl kɔ̱kiɛn kɛ ɣöö bi̱ bai̱ra̱th kulɛ däk piny kɛɛliw. Kɛ kɔr kä mëë caa kapi̱lli̱ri̱ woc, ɛn guɔ̱p ɛmɔ laa jɛ laa la̱thkɛ gua̱a̱thdɛ a gɔaa kɛ ɣöö /cɛ bi̱ lɛ kööt kä bi̱ ley jakä gɔaa. Kä ley cua kɛ jakä gɔw kɛ analjɛthikni̱ (ka̱thpöpen) kɛ ni̱n ti̱ ŋuan kɛ kɔr öperɛciɔn, rɛy gua̱th ɛmɔ cua ta̱a̱ pua̱nykiɛn guic ɛ gɔaa kä kɛ kɔrɛ cua kɛ euthanaidhed kɛ gua̱a̱th ëë ca lar. Kɛn dup diaal cua kɛ la̱t kɛ ta̱a̱ in ca ŋun ɛ ji̱ Yurɔp, naciɔnal kɛnɛ ini̱thti̱tucinal guir kɛnɛ ɣöö cua kɛ apprubi̱d ɛ LandethamtpürNatur duŋ Umwelt kɛnɛ Berbraucherchutz, Nɔth Rhine-Wɛthpalia, Jiɛrmani̱.
Kä ley cua kɛ aneththeti̱d kɛ ketamin (100 mg/kg) kɛnɛ dhailadhin (10 mg/kg), kɛnɛ ɣöö cua lɔcdɛ moc kɛ 0.1 M PBS kɛ nhiam, kɛ kɔrɛ cua 4% PFA rɛy PBS. Kä ti̱cuth cua kɛ da̱a̱k kɛnɛ ɣöö cua kɛ yiath piny rɛy 4% PFA/PBS kɛ wäär kä 4°C. Ɛn thɛp mi̱ rɔal (Leica Mai̱kröthi̱thtɛmni̱ GmbH, Vienna, Ɣɔthti̱ria) cua la̱t kɛ riali̱ tha̱ji̱tal thɛkcini̱ i̱kä (50 μm thi̱k) ɛ bä kä ŋith mi̱ ca yiath piny rɛy PBS. Ɛni̱ mi̱ ca lat kɛ duɔ̱ɔ̱p mi̱ dɔ̱ŋ, bi̱ɛl duŋ thɛkcini̱ tin jäl-ɛ lɔr cua la̱t cie min ca lat nhial (13) kä lëth duëël kɛnɛ ri̱wdɛ. Kɛ gua̱a̱th mi̱ tɔt, kɛ nhiam, kɛn thɛlɛthni̱ tëë ca jiek cua kɛ permeabi̱laidhed kɛ 0.5% Tritɔn X-100/PBS kɛ minitni̱ 15 kä lëth duëël; kɛ kui̱ tha̱a̱ŋ epi̱tɔpni̱ (Pcx kɛnɛ Shmt2), ɛ rɛy tri̱th-EDTA bupper kä 80°C (PH 9) lëthdɛ kä thɛlɛthni̱ kɛ minitni̱ ti̱ 25 ni̱ ɣöö bi̱ ka̱a̱th ɛmɛ te thi̱n. Kɛ kɔrɛ, kɛn thɛkcini̱ cua kɛ inkubɛted kɛ pri̱märi̱ ani̱buɔdi̱ (guic Tɛbɛl S1) rɛy blökiŋ bupper (3% BSA/PBS) kä 4°C kɛ wäär kɛ lëthdɛ. Kɛ cäŋ in dɔ̱ŋ, cua tha̱a̱ŋdɛ lak kɛ blökiŋ bupper kɛnɛ ɣöö cua kɛ inkubɛted kɛ pluöröpɔr-kɔnjugɛted thɛkɔnderi̱ ani̱buɔdi̱ mi̱ ro̱ŋ kɛ thaakni̱ 2 kä lëth duëël; kɛ jɔakdɛ, kɛn thɛkcini̱ cua kɛ lak ɛ gɔaa rɛy PBS, cua kɛ göl-kɛ DAPI, kɛ kɔrɛ cua kɛ riali̱kä kɛ AquaPolymount Kä mai̱kröthkɔɔp i̱thlai̱d.
Ɛ lɛthɛr i̱thkanniŋ kɔnpökal mai̱kröthkɔɔp (TCS SP8-X kiɛ TCS Di̱ji̱tal Lait Ci̱i̱t, Leika Mai̱kröthi̱thtɛmni̱) mi̱ ca riali̱kä kɛ buay lɛthɛr mi̱ bo̱r kɛnɛ 405 dai̱öd alti̱rabai̱lɛt lɛthɛr cua la̱t kɛ thurɛ tha̱mpuɔlä. Kɛ jak pluöröpɔr kä gɔaa kɛnɛ ruuli̱ thi̱knal kɛ Ɣai̱bri̱d Ditektɔr (Ɣai̱Dni̱), LAS-X thɔpwɛɛr cua la̱t kɛ ruuli̱ thurɛni̱ ti̱ ca la̱th gua̱a̱th kɛl mi̱ wä kɛɛl kɛ Ni̱kui̱th tha̱mpuɔli̱ rɛy mödɛl in guur kɛn rɔ̱: kɛ kui̱ nɔ̱n-kuanti̱tɛtib panɛli̱, jɛn ɛ dai̱na̱mik thi̱knali̱ ti̱ di̱t ɛlɔ̱ŋ (cie cäätdɛ, rɛy thömatik thëlli̱ kɛnɛ nämberte duŋ Ɣai̱dthe) kä PDY BrightR mödɛl). Gatiŋ duŋ 0.3 ɛ wä kä 6 ns ɛ mi̱ ca la̱th lät kɛ jak bɛkgi̱rɔɔn kä kuiy.
Rial-tai̱m i̱mëjiŋ duŋ thëlli̱ tin ca kuany. Kɛ kɔr kä mëë ca kɛ da̱a̱k rɛy Neurobathal-A mëdiöm min te 1% B27 tha̱pplemɛn kɛnɛ 0.5 mM GlutaMax, thëlli̱ cua kɛ pith kɛ pɛ̈th kä pöli̱-l-lai̱thin-kɔted gi̱laath i̱thlai̱dni̱ (μ-I̱thlai̱d8 Wɛl, Ibidi, katalɔg nämbär 80826) , kɛnɛ ɣöö kɛ kɔrɛ cua kɛ tɔ̱w kä a% CO2. kɛ ɣöö ba cuɔ̱ŋ. Rial-tai̱m i̱mëjiŋ cua la̱t kä Leica SP8 lɛthɛr i̱thkanniŋ kɔnpökal mai̱kröthkɔɔp mi̱ ca riali̱kä kɛ lɛthɛr mi̱ bo̱r, HyD, 63×[1.4 nämerikal aperciɛr (NA)] ɣöyɔl öbjɛktib lɛni̱ kɛnɛ i̱thtëj mi̱ lëth.
Kä muɔth cua aneththeti̱d kɛ pɛ̈th kɛ karbön daiɣɔkthaid kɛnɛ ɣöö cua wi̱cdɛ woc, ɛn ŋith cua woc kɛ pɛ̈th kä kuɔ̱m, kɛnɛ ɣöö cua ŋuɔ̱k ɛ la 200μm thi̱k (kɛ kui̱ 13C lɛbeliŋ ɣɛkpi̱ri̱mɛn) kiɛ 275μm thi̱k (kɛ kui̱ pötɔn ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ rɛw) tha̱ji̱tal thɛkcin cua thiäŋ kɛ crece mati̱riali̱ The VH-6, Thaanytipik, Walldɔrp, Ji̱ɛrmani̱) ɛ mi̱ ci̱ thia̱a̱ŋ kɛ tha̱bi̱thtanni̱ ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: 125 mM ɣaci̱-kɔld, karbön-tha̱turated (95% O2 kɛnɛ 5% CO2) mi̱ tɔt Ca2 + arti̱pi̱cial thɛrɛbröthpai̱nal pi̱luid (ACHCSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM bupperɛ m32, glukööth, 0.5 mM CaCl2 kɛnɛ 3.5 mM MgCl2 (ɣɔ̱thmötik pi̱rɛjɛr duŋ 310 ɛ wä kä 330 mmol). Gër ŋithä min ca jiek ɛ la mi̱ ca ŋuɔ̱k ɛ wä kä pre-inkubëcin camber min tekɛ Ca2 + ACSF mi̱ di̱i̱t (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM thɔ̱diöm pöthpët bupper, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukööth, 1.25 mM. MgCl2) Mi̱diöm) pH 7.4 kɛnɛ 310 ɛ wä kä 320 mmol).
Rɛy la̱t thurɛkä, kɛn thɛlɛthni̱ cua kɛ naŋ rɛy duëël thurɛkä mi̱ ca lɛy, kɛnɛ ɣöö cua ɣɛkpi̱ri̱mɛn la̱t piny ACSF perpuciɔn mi̱ guur ni̱ rɔ kä lëth mi̱ /ci̱ rɔ gɛr kä 32° ɛ wä kä 33°C. Ɛ ma̱lti̱pötɔn lɛthɛr i̱thkanniŋ mai̱kröthkɔɔp (TCS SP8 MP-OPO, Leika Mai̱kri̱thtɛmni̱) mi̱ ca riali̱kä kɛ Leika 25x öbjɛktib lɛni̱ (NA 0.95, pi̱w), Ti: Thappai̱r lɛthɛr (Cameleon Bi̱ciɔn II, Köɣerent) cua la̱t kɛ thurɛ mi̱ ca ŋuɔ̱k. FLIM mödi̱öl (PiköƔarp300, PiköKuant).
FLIM duŋ Grx1-röGFP2. Kä min ci̱ rɔ gɛr rɛy thai̱töpla̱thmik redɔk wec duŋ PNni̱ cua kɛ thɛm ɛ pötɔn-rɛw FLIM rɛy tha̱ji̱tal ŋithä i̱thlai̱thni̱, gua̱th in bi̱ Grx1-roGFP2 baöthɛnthɔr targɛt PNni̱. Rɛy PN lɛyɛrä, ɛn pi̱e̱l in ca jiek ɛ mi̱ ca kuany ɛ wä kä 50 ɛ wä kä 80 μm piny kä gua̱a̱th in ca ŋuɔ̱k kɛ lärɛ i̱ tëkɛ PN mi̱ bi̱ lät (min la, thiɛl beaded i̱thtra̱kciɛr kiɛ nio̱rɔnal mörpölöji̱kal min gɛɛrɔ ɛ wä bäär kä dendri̱teth) kɛnɛ min la puɔ̱thi̱tib roGFP2 thɛnthɔr kɛnɛ AAVxeath i̱kɔdiŋ ( mCɛri̱). Ruuli̱ thurɛni̱ ti̱ ca la̱th kɛɛl kɛ 2x di̱ji̱tal zuum [ɛkci̱tɛciɔn wɛblɛŋthi̱: 890 nm; 512 nm 512 pi̱dhi̱li̱]. Detekciɔn: rɛydɛ ɛn HyD, pluoreththiin ai̱thöthi̱öthaianat (FITC) pi̱li̱tɛr buɔ̱n] kɛnɛ thurɛ min te kamdiɛn rɛy minitni̱ da̱ŋ 2 ɛ wä kä 3 kɛn la̱tkɛ kɛ lärɛ i̱ pötɔnni̱ ti̱ ro̱ŋ ca kɛ ruuli̱ (1000 pötɔnni̱ kɛɛliw) kɛ kui̱ kä ɣöö ba kurb kulɛ ro̱ŋ. Kä thɛnthi̱ti̱bi̱ti̱ duŋ Grx1-roGFP2 pröb kɛnɛ beri̱pi̱këcin duŋ FLIM kɔndi̱ciɔni̱ cua kɛ la̱t ɛ guic kɛn tëk ba̱li̱ö duŋ roGFP2 mi̱ ca ɣɛkdhöjeni̱öth 10 mM H2O2 mat kä perpuciɔn ACSF (kɛ rëp deɣɔkdhi̱dɛciɔn, bɛ cu nööŋni̱ ɣöö bi̱ tëk rɔ re̱p (mrethidhöm2). kämdɛ piny, bɛ cu nööŋni̱ ɣöö bi̱ tëkdɛ kuɛ̈ɛ̈) (Pi̱guur S8, D ɛ wä kä G). La̱tdɛ FLIMfit 5.1.1 thɔpwɛɛr kɛ di̱e̱l guäc kä min ca jiek, cuɛ ro̱ŋ kɛ thi̱ŋgil ɣɛkpönɛncial dekɛy kurb duŋ thurɛkä kɛɛliw ɛ wä kä thëm IRF (ini̱thtrumɛn ri̱thpɔn pa̱ŋciɔn), kɛnɛ χ2 ɛ mi̱ thi̱ääk kɛ 1. Kɛ kalkulɛciɔn tëkdä duŋ thi̱ŋgil PN kɛnɛ ma̱thki̱ cuɛ tekä tëkdɛ kɛɛliw kä närb. lätdɛ kɛ kui̱ kuanti̱pi̱këciɔn.
Mi̱tökɔndi̱rial buɔ̱mdɛ anali̱thi̱th. Kɛ kɔr kä mëë cua akuut thɛkcin inkubɛted kɛ 100 nM TMRM ɛ jɔc kä cua mat kä perputhed ACSF kɛ minitni̱ ti̱ 30, kä mai̱tökɔndi̱rial buɔ̱mdɛ min ci̱ rɔ gɛr kä PNni̱ cua kɛ thɛm kɛ rɛw-pötɔn mai̱kröthkɔɔp. TMRM i̱mëjiŋ cua la̱t ɛ la mi̱ jak pröb kä 920 nm kɛnɛ la̱tdɛ kɛɛ HyD rɛydɛ (tetramethylrhödamin ai̱thöthi̱öthaianat: 585/40 nm) kɛ ruuli̱ thi̱knali̱; kɛ la̱tdɛ kɛɛ ɣɛkthi̱tɛciɔn wɛblɛŋthi̱ mi̱ cäät duŋni̱ ɣöö la̱tdɛ kɛɛ HyD mi̱ göl rɛydɛ (FITC :525/50) kɛ thurɛ mtYFP. La̱tdɛ ImageJ'ä Image Kalkulɛtɔr plug-in kɛ thëm mai̱tökɔndi̱rial buɔ̱mdɛ kä thi̱ŋgil thëll lɛbel. Rɛydɛ mi̱ ciɛk, ɛn plug-in ekuaciɔn: thi̱knal = min (mtYFP, TMRM) ɛ mi̱ lät kɛ ŋi̱e̱c mai̱tökɔndi̱rial ri̱jin min nyoth TMRM thi̱knal rɛy Purkinje Thɔmali̱ rɛy thi̱ŋgil-i̱thtɛk kɔnpökal thurɛ min tekä canɛl in ro̱m kɛ jɛ. Kɛ kɔrɛ ɛn pi̱dhɛl area rɛy ma̱thki̱ min ci̱ ben raar ɛ mi̱ ca kuɛn, kɛnɛ ɣöö kɛ kɔrɛ ba cu jakä wä kɛɛl kä thrɛthɣo̱ld thi̱ŋgil-i̱thtɛk thurɛ duŋ mtYFP canal kɛ jiek mai̱tökɔndi̱rial pi̱rɛkciɔn min nyoth mai̱tökɔndi̱rial buɔ̱mdɛ.
Kä thurɛ cua da̱a̱k kɛɛ Ɣuyjeni̱ Prö (Thanytipik Böli̱öm I̱mëjiŋ) thɔpwɛɛr. Kɛ kui̱ thurɛni̱ ti̱ ca i̱thkan kä tai̱li̱,kä montɛji̱ duŋ tai̱li̱ kɛl cua la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ autömatik i̱thti̱ciŋ algöri̱thi̱m min ca ŋun ɛ LAS-X thɔpwɛɛr. Kɛ kɔr kä mëë ca thurɛ kali̱brɛciɔn la̱t, lätni ImageJ kɛnɛ Adobe Photoshop kɛ rëp thurɛkä kɛnɛ riali̱ buayä kɛnɛ dääkdɛ i̱kä kɛ duɔ̱ɔ̱p mi̱ cäät. La̱tdɛ Adobe Illuthtratɔr kɛ riali̱kä gi̱ra̱pikni̱.
mtDNA guicɛ ni̱ anali̱thi̱th. Kä nämbär duŋ mtDNA leciɔni̱ cua kuɛn kä cerebellar thɛkcini̱ tëë ca lɛbeli̱d kɛ ani̱buɔdi̱ni̱ ti̱ gua̱c kɛ DNA ɛ kɔnpökal mai̱kröthkɔɔp. Gua̱a̱th in görkɛ kärɔa cua la̱t kɛ kui̱ pua̱a̱ny thëll kɛnɛ ni̱kli̱öth duŋ thëll kɛl, kɛnɛ ɣöö cua gua̱a̱th in ca kalculët kɛ la̱tdɛ kɛɛ Multi Measure plug-in (ImageJ thɔpwɛɛr). Thɔ̱btra̱k ni̱kli̱e̱e̱r area kä thëll pua̱ny area kɛ jiek thaytöpla̱thmik area. Kɛ jɔakdɛ, ɛn Anali̱thi̱th Pa̱rti̱kal plug-in (ImageJ thɔpwɛɛr) cua la̱t kɛ kuën thai̱töpla̱thmik DNA puɔɔni̱ tin nyoth mtDNA kä thrɛthɣo̱ld thurɛ, kɛnɛ ɣöö cua tëë ci̱ ben raar jakä wä kɛɛl kɛ PN aberig duŋ CTRL kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱. Kä min ci̱ ben raar cua lat cie aberig nämbär duŋ ni̱kli̱öthaidni̱ kä thëll kɛl.
Prötien latdɛ anali̱thi̱th. La̱tdɛ ImageJ'ä Image Kalkulɛtɔr plug-in kɛ thëm prötien ëë ca nyoth rɛy PN kä thi̱ŋgil thëll lɛbel. Rɛydɛ mi̱ ciɛk, rɛy thi̱ŋgil-lɛyɛr kɔnpökal thurɛ min tekä canɛl in ca röm, kɛ rɛy ekuëciɔn: thi̱knal = min (mtYFP, ani̱buɔdi̱), kä mai̱tökɔndi̱rial ri̱jin min nyoth i̱mmi̱o̱nöriakti̱bi̱ti̱ kä tha̱a̱ŋ ani̱buɔdi̱ rɛy Purkina ɛ mi̱ ca ŋa̱c. Kɔrɛ ɛn pi̱dhɛl area rɛy ma̱thki̱ min ci̱ ben raar ɛ mi̱ ca kuɛn, kɛnɛ ɣöö kɛ kɔrɛ cua mi̱ thi̱a̱k la̱th kä thrɛthɣo̱ld thi̱ŋgil-i̱thtɛk thurɛ duŋ mtYFP canal kɛ jiek mai̱tökɔndi̱rial pi̱rɛkciɔn duŋ prötien in ca nyoth.
Purkinje thëll denthi̱ti̱ anali̱thi̱th. Kä Thëll Kauntɛr plug-in duŋ ImageJ cua la̱t kɛ thëm Purkinje denthi̱ti̱ ɛ dääk nämbäri̱ Purkinje thëlli̱ tin ca kuɛn kɛ bär cerebellar riŋ min ca naŋ ɛ thëlli̱ tin ca kuɛn.
Riali̱kä tha̱mpuɔlä kɛnɛ ruuli̱dɛ. Kä ŋith kä buɔ̱n kɔnti̱röl kɛnɛ Mfn2cKO kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱r cua kɛ riali̱kä rɛy 2% PFA/2.5% glutaraldeɣaid rɛy 0.1 M pöthpët bupper (PB), kɛ kɔrɛ cua kɔrɔnal thɛkcini̱ riali̱kä kɛ la̱tdɛ kɛɛ thiliates (Leika Mai̱kröthi̱thtɛm GmbH, Vienna, Ɣɔ̱thti̱ria) (Thi̱knɛth μm1 riali̱dɛ i̱kä rɛy The60). tetraɣɔkthaid kɛnɛ 1.5% pötaththi̱öm perröthainaid kä lëth duëël kɛ thaak 1. Kä tha̱a̱ŋdɛ cua kɛ lak ni̱ kä diɔ̱k kɛ pi̱w ti̱ ca liɔm, kä kɛ kɔrɛ cua kɛ moc kɛ 70% ethanöl min tekɛ 1% uranyl acëtat kɛ minitni̱ ti̱ 20. Kä tha̱a̱ŋdɛ cua kɛ jakä jiɛn rɛy gi̱rɛd alkɔl kɛnɛ ɣöö cua kɛ la̱th rɛy Durkupan ACM (Araldite ka̱thtiŋ rɛthi̱n M) epokthi̱ rɛthi̱n (Elɛktrɔn Mai̱kröthkɔɔpi̱ Thaanyni̱, katalög nämbär 14040) kam thi̱li̱kɔn-kɔted gi̱laath i̱thlai̱dni̱, kɛnɛ ɣöö kɛ jɔakdɛ kä 60°C Pöli̱meri̱dhe48 ɣɔbɛn. Kä thɛrɛbellar kɔrtɛk area cua kuany kɛnɛ ɣöö 50 nm alti̱rathin thɛkcini̱ cua kɛ ŋuɔ̱k kä Leika Ultrakat (Leika Mikröthi̱thtɛm GmbH, Vienna, Ɣɔthti̱ria) kɛnɛ ɣöö cua kɛ kuany kä 2×1 mm köpper i̱thli̱t gi̱ri̱d mi̱ ca kum kɛ pöli̱thti̱ri̱n pilim. Kä tha̱a̱ŋdɛ cua kɛ moc kɛ biɛl mi̱ 4% uranyl acëtat rɛy H2O kɛ minitni̱ 10, cua kɛ lak kɛ H2O ni̱ kä ti̱ ŋuan, kɛ kɔrɛ cua kɛ Reynolds lead thi̱trɛt rɛy H2O kɛ minitni̱ 10, kä kɛ kɔrɛ cua kɛ lak kɛ H2O ni̱ kä ti̱ ŋuan. Mai̱krögra̱pni̱ cua kɛ naŋ kɛ tra̱ni̱thmi̱ciɔn elɛkti̱rɔn mai̱kröthkɔɔp Pi̱li̱pni̱ CM100 (Thermö Pi̱ther Thaanytipik, Waltham, MA, USA) kɛ la̱tdɛ kɛɛ TVIPS (Tietdh Bidiö kɛnɛ Thurɛ Thi̱thtɛm) TemKam-F416 di̱ji̱tal kamɛra (TVIPS GmbH, Gautiŋ, USA). Jiɛrmani̱).
Kɛ kui̱ kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ tin ca käp ɛ AAV, ɛn ŋith cua da̱a̱k kä cua ŋuɔ̱k ɛ la 1 mm thi̱k tha̱ji̱tal thɛkcin, kɛnɛ ɣöö cua cerebellum ɣɔ̱n kɛ la̱tdɛ kɛɛ pluorethcen mai̱kröthkɔɔp kɛ ŋi̱e̱c AAV-inpɛktid riŋ (min la, mCherry ɣɛkpreththiŋ). Ɛ ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ kärɔ̱ min bi̱ AAV injɛkciɔn ben raar ɛ la mi̱ di̱i̱t ɛlɔ̱ŋ kä tra̱ni̱thda̱kciɔn ɛppi̱ciɛn duŋ Purkinje thëll lɛyɛr (c.d. cuɛ thia̱k kɛ lɛyɛr kɛɛliw) rɛydɛ mi̱ tɔt kä cerebellar riŋni̱ rɛw ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱ kɛn cua kɛ la̱t. Kä AAV-tra̱ni̱thduciɔn lɔɔp cua mai̱krödi̱ththekted kɛ wär kɛ pöth-pi̱dhɛciɔn (4% PFA kɛnɛ 2.5% glutaraldeɣaid rɛy 0.1 M kɔköat bupper) kɛnɛ ɣöö cua nyɔk kɛ lätni̱. Kɛ kui̱ EPON embeddiŋä, ɛn ti̱cuth in ca yiath piny cua lak kɛ 0.1 M thɔ̱diöm kɔkot bupper (Appli̱kem), kɛnɛ ɣöö cua inkubɛted kɛ 2% OsO4 (öth, Thaany Thärbi̱thni̱; Kakö) rɛy 0.1 M thɔ̱diöm kɔkɔat bupper (Appli̱kem) kɛ thaakni̱ 4, kɛ kɔrɛ cua lak kɛ thaakni̱ 2. Luɔcdɛ ni̱ kä 3 kɛ 0.1 M kɔkamaid bupper. Kɛ kɔrɛ, ɛn thi̱ri̱thni̱ ethanöl tin wä nhial cua kɛ la̱t kɛ inkubɛciɔn ethanöl tha̱luciɔn kɛl kä 4°C kɛ minitni̱ 15 kɛ wuɔ̱c ticiuni̱ rɛy pua̱a̱ny. Kä ti̱cuth cua naŋ kä pröpai̱li̱n ɣɔkthaid kɛnɛ ɣöö cua inkubɛted kɛ wäär rɛy EPON (Thi̱gma-Aldri̱c) kä 4°C. La̱tdɛ ticiu rɛy EPON mi̱ pay ben kä lëth duëël kɛ thaakni̱ da̱ŋ rɛw, kä kɛ kɔrɛ la̱thdɛ kä 62°C kɛ thaakni̱ ti̱ 72. La̱tdɛ kɛɛ alti̱ramikrötöm (Leica Mai̱kröthi̱thtɛmni̱, UC6) kɛnɛ thɛp dai̱mɔn (Dai̱töm, Biel, I̱thwi̱thɛrlɛn) kɛ ŋokdɛ kɛɛ 70 nm alti̱rathin thɛkcini̱, kɛnɛ biɛl kɛ 1.5% uranyl acëtat kɛ minitni̱ 15 kä 37°C, kɛnɛ biɛl kɛ lead thi̱trɛt tha̱luciɔn minitni̱ 4. Kä elɛkti̱rɔn mai̱krögra̱pni̱ cua kɛ naŋ kɛ la̱tdɛ kɛɛ JEM-2100 Pla̱th tra̱ni̱thmi̱ciɔn elɛkti̱rɔn mai̱kröthkɔɔp (JEOL) mi̱ ca riali̱kä kɛ Kamɛra OneBiew 4K 16-bit (Gatan) kɛnɛ Di̱ji̱talMaikrögra̱p thɔpwɛɛr (Gatan). Kɛ kui̱ anali̱thi̱th, elɛkti̱rɔn mai̱krögra̱pni̱ cua kɛ jiek kɛ 5000× kiɛ 10,000× di̱ji̱tal dhuum.
Mörpölöji̱kal anali̱thi̱th duŋ mai̱tökɔndi̱ria. Kɛ kui̱ anali̱thi̱thni̱ diaal, kɛn kɔntuorni̱ nyin mai̱tökɔndi̱ria kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱ cua kɛ nyoth kɛ tet rɛy thurɛni̱ di̱ji̱tal kɛ la̱tdɛ kɛɛ ImageJ thɔpwɛɛr. Mörpölöji̱kal parami̱ti̱ri̱ ti̱ gööl kɛn cua kɛ die̱l guäc. Mi̱tökɔndi̱rial denthi̱ti̱ ɛ mi̱ la nyothkɛ cie perthäntig min jiëkɛ kɛ dääk matdä mai̱tökɔndi̱rial area kä thëll kɛl ɛ thai̱töpla̱thmi̱ area (thai̱töpla̱thmi̱ area = thëll area-thëll ni̱kli̱öth area) × 100. Kä ro̱undnɛth duŋ mai̱tökɔndi̱ria ɛ mi̱ ca kalkulet kɛ puɔrmula [4π∙2(area)]. Kä i̱thta mörpölöji̱ duŋ mai̱tökɔndi̱ria cua die̱l guäc kɛnɛ ɣöö cua da̱a̱k kä rɛw ("tubular" kɛnɛ "bli̱thtɛr") kɛ ta̱a̱diɛn in di̱i̱t.
Ötöpagöthɔm/lai̱thöthɔm nämbär kɛnɛ denthi̱ti̱ anali̱thi̱th. La̱tdɛ ImageJ thɔpwɛɛr kɛ riali̱dɛ i̱kä kɛ tet kä kɔntuorni̱ nyin autopagöthɔm/lai̱thöthɔm kärɔa rɛy thurɛkä di̱ji̱tal. Ɣɔ̱töpagöthɔm/lai̱thöthɔm area ɛ mi̱ la latkɛ cie perthäntig mi̱ ca kalculët kɛ dääk matdä ɣɔ̱töpagöthɔm/lai̱thöthɔm i̱thtra̱kciɛr area duŋ thëll kɛl ɛ thai̱töpla̱thm area (thai̱töpla̱thm area=thëll area-ni̱kli̱öth area)×100. Kä denthi̱ti̱ duŋ ötɔpagöthɔmni̱/lai̱thöthɔmni̱ ɛ mi̱ ca kalculët kɛ dääk nämbärä kɛɛliw kɛ nämbär duŋ ötɔpagöthɔm/lai̱thöthɔm i̱thtra̱kciɛri̱ kä thëll (rɛy täämni̱ duŋ thai̱töpla̱thmik area) (thai̱töpla̱thmik area = thëll area-ni̱kli̱e̱e̱r area).
Labeliŋ kɛ kui̱ akuut thɛkciɔn kɛnɛ riali̱ tha̱mpuɔlä i̱kä. Kɛ kui̱ ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ tin görkɛ glukööth lɛbeliŋ, naŋkɛ akuut ŋithä mi̱ ca ŋuɔ̱k ɛ wä kä pre-inkubëcin camber, min tekɛ tha̱turated karbön (95% O2 kɛnɛ 5% CO2), Ca2 + ACSF mi̱ di̱i̱t (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM thɔ̱diöm Na3O, 1.25 mM thɔ̱diöm pöthpët, 1.25 mM thɔ̱diöm pöthpët. 25.0 mM d-glukööth, 1.0 mM CaCl 2 kɛnɛ 2.0 mM MgCl 2, cua riali̱kä ɛ wä kä pH 7.4 kɛnɛ 310 ɛ wä kä 320 mOsm), rɛydɛ min glukööth ɛ 13 C 6- Glukööth thɔ̱bthi̱thi̱ciɔn (Euri̱thötɔp, katalög nämbär63-1). Kɛ kui̱ ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ tin görkɛ pai̱rubɛt lɛbeliŋ, naŋkɛ akuut ŋithä mi̱ ca ŋuɔ̱k ɛ wä kä Ca2 + ACSF mi̱ di̱i̱t (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM thɔ̱diöm pöthpët bupper, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukööth Ca00M,100 mM. MgCl2, riali̱kä kɛ pH 7.4 kɛnɛ 310 ɛ wä kä 320mOsm), kɛnɛ matdɛ kɛɛ 1mM 1-[1-13C]pai̱rubɛt (Euri̱thötɔp, katalɔg nämbär CLM-1082). Inkubɛt thɛkcini̱ kɛ minitni̱ ti̱ 90 kä 37°C. Kɛ thuɔ̱k ɣɛkpi̱ri̱mɛnä, kɛn tha̱a̱ŋdɛ cua kɛ lak kɛ pɛ̈th kɛ pi̱w ti̱ lawlaw (pH 7.4) min tekɛ 75 mM ammöniöm karbönat, kɛ kɔrɛ cua kɛ ɣömöjeni̱dhed rɛy 40:40:20 (v:v:v) acëtönitrail (ACN): methanöl: pi̱w. Kɛ kɔr kä mëë ca thɛkcini̱ inkubɛted kä ɣaci̱ kɛ minitni̱ ti̱ 30, kɛn tha̱mpuɔli̱ cua kɛ thɛnti̱ri̱puɔɔd kä 21,000 g kɛ minitni̱ 10 kä 4°C, kɛnɛ ɣöö cua thuperna̱tɛn mi̱ jɔc jakä kööt rɛy I̱thpiedBak kɔncentrɛtɔr. Kä mëë ci̱ ben raar ɛ la mi̱ ci̱ kööt kä metɛbölai̱te pellet cua tɔ̱w kä -80°C amääni̱ mëë cua anali̱thi̱th la̱t.
Li̱ki̱öd krömatögra̱pi̱-ma̱th i̱thpekti̱römeti̱ri̱ anali̱thi̱th duŋ 13 C-lɛbeli̱d aminö athi̱dni̱. Kɛ kui̱ li̱kuid krömatögra̱pi̱-ma̱th i̱thpekti̱römeti̱ri̱ (LC-MS) anali̱thi̱th, ɛn metɛbölai̱te pellet cua nyɔk kɛ thɔ̱thpɛndiŋ rɛy 75μl duŋ LC-MS gi̱rɛd pi̱i̱ni̱ (Ɣöni̱wɛll). Kɛ kɔr thɛnti̱ri̱pugɛciɔn kä 21,000 g kɛ minitni̱ 5 kä 4°C, 20 μl duŋ thuperna̱tɛn ëë ca lɛy cua la̱t kɛ kui̱ aminö athi̱d pluk anali̱thi̱th, niɛ gua̱a̱ mɔ cua min ci̱ duɔth kä ɣɛktra̱k la̱t kɛ pɛ̈th kɛ kui̱ ani̱ön anali̱thi̱th (guic piny). Aminö athi̱d anali̱thi̱th cua la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ bendhöyl klɔraid deri̱bati̱dhëcin prötökɔɔl (55, 56) mëë ca lat ni̱ wän. Rɛy ka̱a̱th in nhiam, 10μl duŋ 100 mM thɔ̱diöm karbönat (Thi̱gma-Aldri̱k) cua mat kä 20μl duŋ metɛbölai̱te ɣɛktra̱k, kɛ kɔrɛ cua 10μl duŋ 2% bendhöil klɔraid (Thi̱gma-Aldri̱k) mat kä LC gi̱rɛd ACN. Kä tha̱mpuɔl cua vortex kɛ gua̱a̱ mi̱ tɔt kä kɛ kɔrɛ cua thɛnti̱ri̱puɔɔd kä 21,000 g kɛ minitni̱ 5 kä 20°C. Tra̱ni̱thpɛr thuperna̱tɛn min ca woc kä 2 ml autötha̱mpuɔlr vial kɛ kɔni̱kal gi̱laath in ca la̱th thi̱n (200 μl bɔli̱öm). Kä tha̱mpuɔli̱ cua kɛ die̱l guäc kɛ la̱tdɛ kɛɛ Akui̱ti̱ti̱ iKla̱th alti̱ra-ɣai̱ perpörmɛn LC thi̱thtɛm (Pi̱w) mi̱ ca röm kɛ Q-Ɣɛkdhaktib (QE)-HF (Ultra Ɣai̱ Pi̱e̱l Örbi̱trap) ɣai̱-rethölucin preci̱ciɔn ma̱th i̱thpekti̱römi̱ti̱r (Thermö Pi̱ther Thaanytipik). Kɛ kui̱ anali̱thi̱th, 2μl duŋ deri̱bati̱dhed tha̱mpuɔl cua tuɔm rɛy 100×1.0 mm mi̱ di̱i̱t-buɔm thi̱li̱ka T3 kɔlöm (Pi̱w) min tekɛ 1.8μm pa̱rti̱käli̱. Kä ja̱lɛ ɛ 100μl/min, kɛnɛ ɣöö ɛn bupper thi̱thtɛm tëkɛ bupper A (10 mM ammöniöm puɔrmat kɛnɛ 0.15% puɔrmik athi̱d rɛy pi̱i̱ni̱) kɛnɛ bupper B (ACN). Kä gi̱rɛdiɛn ɛ mi̱ ce̱tkɛ mi̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: 0%B kä 0 minitni̱; 0%B. 0 ɛ wä kä 15% B kä 0 ɛ wä kä 0.1 minitni̱; 15 ɛ wä kä 17% B kä 0.1 ɛ wä kä 0.5 minitni̱; B kä 17 ɛ wä kä 55% kä 0.5 ɛ wä kä 14 minitni̱; B kä 55 ɛ wä kä 70% kä minitni 14 ɛ wä kä 14.5; kä 14.5 ɛ wä kä 70 ɛ wä kä 100% B kä minitni 18; 100% B kɛ minitni̱ da̱ŋ 18 ɛ wä kä 19; 100 ɛ wä kä 0% B kɛ minitni̱ 19 ɛ wä kä 19.1; 0% B kä 19.1 ɛ wä kä 28 minitni̱ (55, 56). Kä QE-HF ma̱th i̱thpekti̱römi̱ti̱r lätdɛ rɛy puɔ̱thi̱tib aönaidhɛciɔn mödɛl kɛ ma̱th rɛŋ duŋ m/z (ma̱th/ca̱rji̱ rɛci̱ö) duŋ 50 ɛ wä kä 750. Kä appli̱ked rethölucin ɛ 60,000, kɛnɛ ɣöö min ca jiek kä kɔnti̱röl (AGC) ai̱ön targɛt min ca jiek ɛ 3×106, kɛnɛ ɣöö ɛn makdhi̱ma̱m ai̱ön thaak ɛ mi01. Kä lëth elektröthpi̱rɛy aönaidhɛciɔn (ESI) gua̱a̱th in tuɔɔkɛ thi̱n lätdɛ kä i̱thprey böltɛj duŋ 3.5 kV, ɛ kapi̱llari̱ lëth duŋ 250°C, ɛ thi̱ath jiɔm mi̱ jäl ɛ 60 AU (arbi̱trɛri̱ yunitni̱), kɛnɛ ɛ audhi̱li̱ɛri̱ jiɔm mi̱ jäl ɛ 20 AU. 250°C. Kä S lɛni̱ cua yiath piny kä 60 AU.
Ani̱ön krömatögra̱pi̱-MS anali̱thi̱th duŋ 13C lɛbeli̱d ɣɔrganik athi̱dni̱. Kä metɛbölai̱te min ci̱ duɔth kä prɛcipi̱tɛt (55μl) cua die̱l guäc kɛ la̱tdɛ kɛɛ Dionex ayɔn krömatögra̱pi̱ thi̱thtɛm (ICS 5000+, Thermö Pi̱ther Thaanytipik) mi̱ ca röm kɛ QE-HF ma̱th i̱thpekti̱römi̱ti̱r (Thermö Pi̱ther Thaanytipik). Rɛydɛ mi̱ ciɛk, 5μl duŋ metɛbölai̱te ɣɛktra̱k cua tuɔm rɛy Dionex IonPac AS11-HC kɔlöm mi̱ ca riali̱kä kɛ HPLC (2 mm×250 mm, di̱t pa̱rti̱käl 4μm, Thermö Pi̱ther Thaanytipik) rɛy puɔ̱th-rɛyni̱ tha̱a̱ŋ lɔɔp mödɛl kɛ thiäŋ rɛci̱ö duŋ 1.)kä. Dai̱önɛk Ai̱ɔnPak AG11-HC gaŋ kɔlöm (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermö Pi̱ther Thaanytipik). Kä lëth kɔlömni̱ cua rɔm kä 30°C, kɛnɛ ɣöö ɛn autötha̱mpuɔl ɛ mi̱ ca la̱th kä 6°C. La̱tdɛ pötaththi̱öm ɣai̱dröɣai̱d kartudhi̱ min ca ŋun kɛ pi̱w ti̱ deaönaidhed kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ pötaththi̱öm ɣai̱dröɣai̱d gi̱rɛdiɛn kɛ rɛy eluɛn jenerɛtɔr. Kä dääk metɛbölai̱teth kɛ ja̱l mi̱ 380μl/min, läthdɛ lät kɛ gi̱rɛdiɛn mi̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: 0 ɛ wä kä 3 minitni̱, 10 mM KOH; 3 ɛ wä kä 12 minitni̱, 10 ɛ wä kä 50 mM KOH; 12 ɛ wä kä 19 minitni̱, 50 ɛ wä kä 100 mM KOH; 19 ɛ wä kä 21 minitni̱ , 100 mM KOH; 21 ɛ wä kä 21.5 minitni̱, 100 ɛ wä kä 10 mM KOH. Kä kɔlöm cua nyɔk kɛ-ɛkui̱li̱brɛted piny 10 mM KOH kɛ minitni̱ 8.5.
Kä eluted metɛbölai̱teth kɛn cua kɛ mat kɛɛ 150μl/min ai̱thöpröpanöl tha̱pplemɛn i̱thti̱riam kɛ kɔr kɔlömni̱ kɛnɛ ɣöö kɛ kɔrɛ cua kɛ riet kä ɣai̱-rethölucin ma̱th i̱thpekti̱römi̱ti̱r min lät rɛy negɛtib aönaidhɛciɔn mödɛl. MS ɛ mi̱ guicɛ di̱tdɛ ɛ tokɛ kä m/z 50 ɛ wä kä 750 kɛ rethölucin duŋ 60,000. Kä AGC ɛ mi̱ ca yiath piny kä 1×106, kɛnɛ ɣöö ɛn thaak ayɔn in di̱tni̱ jɛn cua yiath piny kä 100 ms. Kä gua̱a̱th in tuɔɔk ESI thi̱n min ca leth cua la̱t kä i̱thpi̱rɛy böltɛj duŋ 3.5 kV. Kä thɛttiŋni̱ kɔ̱kiɛn tin tuɔɔk kä ayɔn kɛn kɛ ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: kapi̱lli̱ri̱ lëthdɛ 275°C; thɛth ga̱th mi̱ jäl, 60 AU; audhi̱li̱ɛri̱ ga̱th mi̱ wä, 20 AU kä 300°C, kɛnɛ S lɛni̱ thɛttiŋ ɛ wä kä 60 AU.
Data anali̱thi̱th duŋ 13C lɛbeli̱ metɛbölai̱teth. La̱tdɛ TracePainder thɔpwɛɛr (berciɔn 4.2, Thermö Pi̱ther Thaanytipik) kɛ kui̱ data ni̱ anali̱thi̱th duŋ ai̱thötɔp rɛci̱ö. Kä ŋi̱e̱c kɔmpuɔɔnä kɛl cua beri̱pi̱d ɛ repi̱rɛn kɔmpuɔɔn mi̱ ŋa̱thkɛ kɛnɛ ɣöö cua die̱l guäc kärɔa. Rɛy kä ɣöö ba ai̱thötɔp enri̱cimɛn anali̱thi̱th la̱t, ɛn gua̱a̱th in ca ɣɛktra̱kted ai̱ön krömatögra̱m (XIC) duŋ 13C ai̱thötɔp (Mn) kärɔa cua woc kä [M + H] +, gua̱th in bi̱ n ɛ karbön nämbär duŋ targɛt kɔmpuɔɔn, cua la̱t kɛ anali̱thi̱th aminö athi̱dni̱ kiɛ [MH] + ɛ mi̱ lät kɛ anali̱thi̱th ani̱öni̱. Kä pekdɛ min thuɔ̱k kä XIC ɛ mi̱ kuiy ni̱ jɛn kä tha̱a̱ŋ gua̱thni̱ da̱ŋ dhie̱e̱c kä mi̱lli̱ön, kä min thuɔ̱k kä RT ɛ 0.05 minitni̱. Kä enri̱cimɛn anali̱thi̱th ɛ mi̱ la̱tkɛ kɛ kalkulɛciɔn rɛci̱ö duŋ ai̱thötɔp kɛl min ca jiek ɛ wä kä mat ai̱thötɔpni̱ diaal kä kɔmpuɔɔn in ca röm. Rëci̱öni̱ ti̱ti̱ cua kɛ ŋun cie perthäntig ba̱liömmi̱ kä ai̱thötɔp kɛl, kɛnɛ ɣöö kɛn tin ci̱ ben raar cua kɛ lat cie mölar perthän enri̱cimɛn (MPE), cie min ca lat ni̱ wän (42).
Kä nio̱rɔn pellet ëë ci̱ kɔ̱c cua ɣömöjeni̱dhed rɛy ɣacä-kɔld 80% methanöl (v/v), cua vortɛkdɛd, kɛnɛ ɣöö cua inkubɛted kä -20°C kɛ minitni̱ ti̱ 30. Vortex tha̱mpuɔl ɛ nyɔk kɛnɛ ɣöö nyɔkɛ jɛ kɛ lëp kä +4°C kɛ minitni̱ ti̱ 30. Kä tha̱mpuɔl cua thɛnti̱ri̱puɔɔd kä 21,000 g kɛ minitni̱ 5 kä 4°C, kɛ kɔrɛ cua thuperna̱tɛn ëë ci̱ ben raar ruuli̱ kɛnɛ ɣöö cua jakä kööt kɛ la̱tdɛ kɛɛ I̱thpiedBak kɔncentrɛtɔr kä 25°C kɛ kui̱ anali̱thi̱th ëë guur jɛ. Cie min ca lat nhial, LC-MS anali̱thi̱th cua la̱t kä aminö athi̱dni̱ duŋ thëlli̱ tin ca kuany. Mi̱ la̱tkɛ TracePainder (berciɔn 4.2, Thermö Pi̱ther Thaanytipik), data anali̱thi̱th cua la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ mönöai̱thötɔpik ma̱th duŋ kɔmpuɔɔn kärɔa. Kuanti̱le nɔrmalaidhɛciɔn duŋ metɛbölai̱te data cua la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ prepröthɛthKɔre thɔpwɛɛr pakɛmɛ (57).
Kä riali̱kä thɛlɛthni̱. Kä muɔth cua aneththeti̱d kɛ pɛ̈th kɛ karbön daiɣɔkthaid kɛnɛ ɣöö cua wi̱cdɛ woc, ɛn ŋith cua woc kɛ pɛ̈th rɛy cɔ̱ɔ̱kä, kɛnɛ ɣöö cua thɛp mi̱ ci̱ thia̱a̱ŋ kɛ ɣa̱c (HM-650 V, Thermö Pi̱ther Thaanytipik, Walldörp, Germany) cua la̱t kɛ ŋuɔ̱kdɛ rɛy 300 ɛ wä kä 375 μm karbön O2m. CO2) Ca2 mi̱ tɔt + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM thɔ̱diöm pöthpët bupper, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukööth, 1.0 mM CaCl2 kɛnɛ 6.0 mM Mg41 ɛ wä kä pH302. mÖthi̱m). Gër ŋithä min ca jiek ɛ la mi̱ ca ŋuɔ̱k kä cambɛr min tekɛ Ca2 + ACSF mi̱ di̱i̱t (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM thɔ̱diöm pöthpët bupper, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glukööth, 4.0 mM Ca5. kɛnɛ 310 ɛ wä kä 320 mOthm). Kämni thɛlɛthni̱ thi̱n kɛ minitni 20 ɛ wä kä 30 kɛ ɣöö bi̱ kɛ kulɛ luny jɔk ɛ ŋot kän i kɛ ni la̱th rɛy ri̱kɔrdiŋä.
ri̱kɔrdiŋ. Ɛ mai̱kröthkɔɔp i̱thtëj mi̱ ca riali̱kä kɛ ri̱kɔrdiŋ camber mi̱ ca riali̱kä kɛnɛ 20x pi̱w immerciɔn objɛktib lɛni̱ (Thanytifika) cua la̱t kɛ ri̱kɔrdiŋni̱ diaal. Kä putatip Purkinje thëlli̱ cua kɛ ŋic ɛ (i) di̱t pua̱a̱ny, (ii) anatömi̱kal gua̱a̱th in te cerebellum thi̱n, kɛnɛ (iii) latdɛ duŋ pluorethɛn mtYFP ri̱pɔrtɛr ji̱i̱n. Kä patch pi̱pɛt min tekɛ tip redhi̱tan duŋ 5 ɛ wä kä 11 megöɣmni̱ ɛ mi̱ ca woc ɛ böröthi̱li̱kat gi̱laath kapi̱lli̱ri̱ (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Thaany Pröda̱kni̱, Ɣo̱pɣi̱m, Ji̱ɛrmani̱) kɛnɛ ɣɔri̱dhɔntal pi̱pɛt Ini̱thti̱rumɛni̱ (P-1000, CA). Kä ri̱kɔrdiŋni̱ diaal cua kɛ la̱t ɛ ELC-03XS npi patch klamp ampli̱pie̱e̱r (npi elɛkto̱ro̱nik GmbH, Tam, Ji̱ɛrmani̱), min cua kɔnti̱röl ɛ thɔpwɛɛr Thi̱knal (berciɔn 6.0, Kambri̱ji̱ Elɛkto̱nik, Kambri̱ji̱, UK). Kä ɣɛkpi̱ri̱mɛn cua ri̱kɔrdi̱d kä tha̱mpuɔli̱ rɛt duŋ 12.5 kHz. Kä thi̱knal ɛ mi̱ ca pi̱li̱tɛr kɛ Beththel pi̱li̱tɛri̱ rɛw ti̱ ciɛk-ciɛk kɛ cutɔp prekuɛnthi̱ni̱ duŋ 1.3 kɛnɛ 10 kHz kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱. Kä kapacitan duŋ membi̱ran kɛnɛ pi̱pɛt ɛ mi̱ ca kum ɛ kɔmpi̱ɛnciɔn thärki̱o̱t min lät kɛ ampli̱pie̱e̱r. Ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ diaal cua kɛ la̱t piny kɔnti̱röl duŋ Orka-Pla̱th 4.0 kamɛra (Ɣamathu, Gerden, Jiɛrmani̱), min cua kɔnti̱röl ɛ Ɣokawo thɔpwɛɛr (berciɔn 2.8, Ɣamathu, Gerden, Jiɛrmani̱).
Röti̱n thëll-kɛliw kɔni̱gi̱ra̱pɛciɔn kɛnɛ anali̱thi̱th. Niɛ gua̱a̱th ɛmɔ ɛ ŋot /ka̱nɛ ni̱ ri̱kɔrdi̱d, thiäŋ pi̱pɛt kɛ rɛydɛ min tekɛ tha̱bi̱thtanni̱ ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM pötaththi̱öm glukɔnat, 10.0 mM Ɣepɛth, 4.0 mM trai̱pötethin (m) (Na) kɛnɛ 10.0 mM kreatinain pöthpët cua kɛ riali̱kä ɛ wä kä pH 7.25, kɛnɛ ɣöö ɛn öthmötik pi̱rɛjɛr cuɛ 290 mOsm (thukröth). Kɛ pɛ̈th kɛ kɔr kä mëë ca buɔ̱m duŋ 0 pA la̱th thi̱n kɛ däkdɛ kɛɛ membi̱ran, cua membi̱ran in ci̱ duɔth buɔ̱mdɛ thɛm. Kä input redhi̱tan ɛ mi̱ ca thɛm kɛ läth ɣai̱perpölari̱dhed karɛntni̱ duŋ -40, -30, -20, kɛnɛ -10 pA. Thɛm magni̱ti̱öd duŋ bɔltɛj ri̱thpɔn kɛnɛ ɣöö lätdɛ ŋuɔ̱t Ɣöm'ä kɛ kalkuli̱ input ri̱dhi̱thti̱ciɔn. I̱thpɔntaneöth ɛkti̱bi̱ti̱ cua ri̱kɔrdi̱d rɛy böltɛj klamp kɛ minitni̱ 5, kɛnɛ ɣöö cua sPSC ŋic kɛnɛ ɣöö cua thɛm rɛy Igor Prö (berciɔn 32 7.01, WaveMetricni̱, Lake Öthwi̱gö, Oregon, USA) kɛ la̱tdɛ kɛɛ themi-autömatik ŋi̱e̱c i̱thki̱ri̱p. Kä IV kurb kɛnɛ i̱thtëdi̱-i̱thtët karɛnt kɛn thɛm kɛ kɛ käm bɛtteri̱ kä buɔ̱mdiɛn ti̱ gööl (tuɔkdɛ kä -110 mV) kɛnɛ rëp bɔltɛj rɛy 5 mV ka̱a̱th. Kä la̱t AP cua ɣɔ̱n kɛ läthdɛ lät kɛ depölari̱dhiŋ karɛnt. Klamp thëll kä -70 mV niɛ gua̱a̱ mɔ lät depölari̱dhiŋ karɛnt pulth. Riali̱ step tha̱ydh kä yunit ri̱kɔrdiŋä kɛl kärɔa (10 ɛ wä kä 60 pA). Kä AP prekuɛnci̱ min di̱tni̱ jɛn kä kuɛn kɛ tet min no̱o̱ŋ AP prekuɛnthi̱ min di̱tni̱ jɛn. Kä AP thrɛthɣo̱ld ɛ mi̱ ca die̱l guäc kɛ la̱tdɛ kɛɛ thɛkɔnd deri̱bɛtip duŋ depölari̱dhëcin pulth min nhiam min no̱o̱ŋ kɛl kiɛ APni̱ ti̱ ŋuan.
Perpörɛted patch kɔni̱gi̱ra̱pɛciɔn kɛnɛ anali̱thi̱th. La̱tdɛ perpörated patch ri̱kɔrdiŋ kɛ la̱tdɛ kɛɛ i̱thtandar prötokɔ̱li̱. La̱tdɛ ATP- kɛnɛ GTP-pi̱pɛt mi̱ thiɛl mi̱ ca mat thi̱n: 128 mM glukɔnat K, 10 mM KCl, 10 mM Ɣepeth, 0.1 mM EGTA kɛnɛ 2 mM MgCl2, kɛnɛ ɣöö ba pH 7.2 riali̱kä (kɛ la̱tdɛ kɛɛ KOH). ATP kɛnɛ GTP laa kɛ laa wockɛ kä intrathëllular thɔ̱luciɔn kɛ ga̱ŋ permeabi̱li̱ti̱ in /caa luäŋ kɛ ga̱ŋ kä thëll membɛrɛn. Kä patch pi̱pɛt ɛ mi̱ ca thiäŋ kɛ ampöteri̱thi̱n-min te rɛydɛ kɛɛ thɔ̱luciɔn (ɛ thia̱k kɛ 200 ɛ wä kä 250 μg/ml; G4888, Thigma-Aldri̱k) kɛ jiek kä min ca gɔ̱r piny kä patch in ca perpörated. Ampöteri̱thi̱n cua liɔm rɛy dai̱methi̱l tha̱lpɔkthaid (guutdɛ min ci̱ thi̱a̱a̱ŋ: 0.1 ɛ wä kä 0.3%; DMSO; D8418, Thigma-Aldri̱k). Kä kɔncentrɛciɔn duŋ DMSO mëë ca la̱t cuɛ thiɛl mi̱ cuɛ nyoth kä nio̱rɔni̱ tëë ca ŋi̱e̱e̱c. Rɛy la̱t punchiŋä, ɛn canal ri̱dhi̱thti̱ciɔn (Ra) cua guic ɛ ŋotdɛ, kɛnɛ ɣöö cua ɣɛkpi̱ri̱mɛn tok kɛ kɔr kä mëë ci̱ ampli̱ti̱öd duŋ Ra kɛnɛ AP i̱thtabi̱lai̱dhed (minitni̱ 20-40). I̱thpɔntani̱öth ɛkti̱bi̱ti̱ ɛ mi̱ thɛmkɛ rɛy bɔltɛj kɛnɛ/kiɛ karɛnt klamp kɛ minitni̱ 2 ɛ wä kä 5. Data ni̱ anali̱thi̱th cua la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ Igor Prö (berciɔn 7.05.2, WɛbMetrikni̱, USA), Ɛkthel (berciɔn 2010, Mai̱kröötht Kɔrpörëcin, Redmɔn, USA) kɛnɛ Gi̱ra̱pPad Pri̱dhi̱m (berciɔn 8.1.2, Gi̱ra̱pPad Thɔpwɛɛr Inc., La Jolla, CA). Yunai̱tid I̱thtët). Rɛy kä ɣöö ba APni̱ tin tuɔɔk kärɔ̱ ŋa̱c, IgorPrö'ä NeuroMatik v3.0c plug-in cua la̱t. APni̱ ŋic kɛn rɔ̱ kärɔa kɛ la̱tdɛ kɛɛ thrɛthɣo̱ld mi̱ ca ŋun, min ca riali̱kä kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱ kɛ kui̱ ri̱kɔrdä kɛl. Mi̱ lätdɛ kɛɛ i̱thpi̱k intɛrbal, jiek i̱thpi̱k prekuɛnthi̱ kɛ makdhi̱ma̱m inthtantaneöth i̱thpi̱k prekuɛnthi̱ kɛnɛ aberig i̱thpi̱k prekuɛnthi̱.
PN ai̱thölɛciɔn. Mi̱ ca rɔ ŋic kɛ prötokɔ̱l ëë ca ka̱m raar ni̱ wal, PNni̱ cua kɛ riali̱kä kä muɔth cerebellum kä i̱thtëj mi̱ ca lɛy (58). Rɛydɛ mi̱ ciɛk, ɛn cerebellum cua da̱a̱k kɛnɛ ɣöö cua ŋok rɛy ɣaci̱-kɔld di̱thöciëcin mëdiöm [thiɛlɛ HBSS Ca2+ kɛnɛ Mg2+, cua mat kɛɛ 20 mM glukööth, pɛni̱thilli̱n (50 U/ml) kɛnɛ i̱thtreptömaithin (0.05 mg/ml)], kɛ kɔrɛ cua mi̱diöm mat thi̱n [mgSS-thi̱thtien, papal1 / ml), papain (16 U / ml) kɛnɛ deɔkthai̱ri̱böni̱kli̱eth I (DNathe I; 0.1 mg/ml)] La̱tdɛ kɛ minitni̱ da̱ŋ 30 kä 30°C. Kɛ nhiam lak ticiuni̱ rɛy HBSS mëdiöm min tekɛ egg muka̱th (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) kɛnɛ DNathe (0.1 mg/ml) kä lëth duëël kɛ ga̱ŋ endhɛmatik dai̱jɛciɔn, kɛ kɔrɛ rɛy HBSS mëdiöm min tekɛ 20 mM glukööth (HBlmi̱lm0), mi̱ ca thɛm ɛ määth rɛy HBlm00. (0.05 mg/ml) kɛnɛ DNathe (0.1 mg/ml) la kɛn thëlli̱ ti̱ gööl ɛ ka̱m raar. Kä thëll tha̱thpɛnciɔn ëë ci̱ ben raar cua kɛ lak kɛ rɛy 70μm thëll i̱thtrainɛr, kɛ kɔrɛ cua thëlli̱ pelletted ɛ thɛnti̱ri̱pugɛciɔn (1110 rpm, minitni̱ 5, 4°C) kɛnɛ ɣöö cua kɛ nyɔk kɛ tha̱thpɛnciɔn rɛy thɔ̱rti̱ mëdiöm [HBSS, cua mat kɛɛ 20 mM glukööth, 20% fetal i̱thti̱rein Umai̱lin) Therum, (0.05 mi̱g/mi̱l)]; thëm thëll bai̱bili̱ti̱ kɛ pröpi̱diöm ai̱ödaid kɛnɛ riali̱ thëll denthi̱ti̱ i̱kä ɛ wä kä 1×106 ɛ wä kä 2×106 thëlli̱/ml. Ɛ ŋot /ken thaytömetri̱ ni̱ wä, ɛn tha̱thpɛnciɔn cua jɛ lak kɛ rɛy 50 μm thëll i̱thtrainɛr.
Plöw thai̱tömi̱ti̱r. Thëll thɔ̱rtiŋ cua la̱t kä 4°C kɛ la̱tdɛ kɛɛ FACSAria III maciin (BD Baöthai̱thni̱) kɛnɛ FACSDiva thɔpwɛɛr (BD Baöthai̱thni̱, berciɔn 8.0.1). Kä thëll tha̱thpɛnciɔn cua da̱a̱k kɛ la̱tdɛ kɛɛ 100 μm nɔdhɛl piny pi̱rɛjɛrä duŋ 20 psi kä rɛt duŋ ~2800 i̱bɛni̱/thek. Ni̱ mëë tradi̱ciɔnal gatiŋ kri̱teria (thëll di̱tdɛ, baimödal di̱thki̱ri̱minaciɔn, kɛnɛ ciɛŋ tin ca däk piny) /cɛ de luäŋ kɛ lärɛ i̱ ba PN da̱a̱k ɛ gɔaa kä thëlli̱ kɔ̱kiɛn, ɛn gatiŋ i̱thtrateji̱ cua yiath piny kɛ pääri̱dɛ min jɔc kä YFP intenthi̱ti̱ kɛnɛ autöpluorethcen rɛy mai̱töYFP+ kɛnɛ kɔnti̱röl mai̱töYFP-. YFP ɛ mi̱ ca jakä tɛth ɛ irradiatiŋ tha̱mpuɔl kɛ 488 nm lɛthɛr lany, kɛnɛ ɣöö ɛn thi̱knal cua jiek kɛ la̱tdɛ kɛɛ 530/30 nm ba̱nd pa̱th pi̱li̱tɛr. Rɛy mai̱töYFP+ kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱, ɛn buɔ̱m in thi̱ääk kɛ Rotha26-mitöYFP ri̱pɔrtɛr ji̱i̱n jɛn bä lätdɛ kɛ dääk pua̱a̱ny nio̱rɔnal kɛnɛ adhɔn pragmɛni̱. 7-AAD ɛ mi̱ ca jakä tɛth kɛɛ 561 nm lɛthɛr mi̱ tɔ̱c kɛnɛ ɣöö cua jiek kɛ 675/20 nm ba̱ndpa̱th pi̱li̱tɛr kɛ wuɔ̱c thëlli̱ tin ci̱ li̱w. Rɛy kä ɣöö ba athtrothai̱teth da̱a̱k kɛ jɛn gua̱th ɛ kɛlɔ, ɛn thëll tha̱thpɛnciɔn cua biɛl kɛ ACSA-2-APC, kɛ kɔrɛ cua tha̱mpuɔl irradiated kɛ 640 nm lɛthɛr lany, kɛnɛ 660/20 nm ba̱ndpa̱th pi̱li̱tɛr cua la̱t kɛ ŋi̱e̱c thi̱knal.
Kä thëlli̱ tëë ca ruuli̱ cua kɛ pelleted ɛ thɛnti̱ri̱pugɛciɔn (1110 rpm, minitni̱ 5, 4°C) kɛnɛ ɣöö cua kɛ tɔ̱w kä -80°C amääni̱ mëë cua kɛ la̱t. Mfn2cKO kuɔ̱ndhuɔ̱ɔ̱ri̱ kɛnɛ gaatkiɛn tin tɔatni̱ cua kɛ da̱a̱k kɛ cäŋ kɛl kɛ jak pröciɛral bariabi̱li̱ti̱ kä kuiy. FACS data ni̱ nyuɔ̱thdiɛn kɛnɛ di̱l guecdiɛn cua la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ PlöwJö thɔpwɛɛr (PlöwJö LLC, Athland, Oregon, USA).
Cie min ca lat nhial (59), ri̱i̱l-tai̱m PCR ɛ mi̱ lät kɛ ai̱thölɛciɔn DNA kä nio̱rɔni̱ tin ca kuany kɛ kui̱ mtDNA kua̱nti̱pi̱këcin in guur kɛn ɛ. Kä li̱ni̱e̱e̱ri̱ti̱ kɛnɛ thrɛthɣo̱ld thɛnthi̱ti̱bi̱ti̱ cua kɛ tok kɛ thëm ɛ lät qPCR kä nämbäri̱ thëlli̱ ti̱ gööl. Kɛ ciɛk, ruuli̱ 300 PN rɛy lai̱thith bupper min tekɛ 50 mM tri̱th-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Twin 20 kɛnɛ prötienathe K (200 ng/ml) kɛnɛ ɣöö ba inkubɛt kä 55°C minitni̱ ti̱ 120. Kä thëlli̱ cua kɛ nyɔk kɛ inkubɛted kä 95°C kɛ minitni̱ 10 kɛ lärɛ i̱ prötienathe K /cɛ lät ɛ thuɔ̱k. La̱tdɛ kɛɛ TaqMan pröb (Thermö Pi̱ther) mi̱ ca lɛy kä mt-Nd1, mtDNA cua thɛm ɛ themi-kuanti̱tɛtib PCR rɛy 7900HT Rial-Taim Pi̱ciɛnthɛr PCR thi̱thtɛm (Therr). Thaany, katalɔg nämbär Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermö Pi̱ther Thaanytipik, katalɔg nämbär AIVI3E8) kɛnɛ 18S (Thermö Pi̱ther Thaanytipik, katalɔg nämbär Hs99999901_s1) ji̱i̱ni̱.
Prötiome tha̱mpuɔl riali̱kä. Mi̱ ca thɔ̱luciɔn jakä leth kä 95°C kɛ minitni̱ 10 kɛnɛ thɔ̱ni̱kɛtiŋ, rɛy lai̱thith bupper [6 M guani̱din klɔraid, 10 mM tri̱th(2-karbökthi̱ethyl) pöthpi̱i̱n ɣai̱dröklɔraid, 10 mM klöröacetamid kɛnɛ 100 mM tri̱th-HC pellet rɛy nio̱rɔlä mi̱ ci̱ kɔ̱c]. Kä Baöruptɔr (Diagenode) kɛ minitni̱ da̱ŋ wäl (30 thɛkɔndi̱ni̱ pulth / 30 thɛkɔndi̱ni̱ pa̱th pi̱riööd). Kä tha̱mpuɔl cua jakä kuiy 1:10 rɛy 20 mM tri̱th-HCl (pH 8.0), cua li̱ɔɔm kɛ 300 ng tri̱pthin da̱a̱p (Prömega), kɛnɛ ɣöö cua inkubɛted kɛ wäär kä 37°C kɛ jiek kä ɣöö bɛ kulɛ thuɔ̱k kɛ mi̱eth. Kɛ cäŋ in rɛwdɛ, ɛn tha̱mpuɔl cua thɛnti̱ri̱puɔɔd kä 20,000 g kɛ minitni̱ ti̱ 20. Kä thuperna̱tɛn cua jakä kuiy kɛ 0.1% puɔrmik athi̱d, kɛnɛ ɣöö cua thuluciɔn woc kɛ thɛlp-made I̱thtëjTipni̱. Kä tha̱mpuɔl cua jakä kööt rɛy I̱thpiedBak ini̱thtrumɛn (Eppendɔrp kɔnthenthɛtɔr matdɛ 5305) kä 45°C, kɛ kɔrɛ cua peptaid ŋok rɛy 0.1% puɔrmik athi̱d. Tha̱mpuɔli̱ diaal cua kɛ riali̱kä kɛ gua̱a̱th kɛl ɛ ram kɛl. Rɛy kä ɣöö ba athtrothai̱te tha̱mpuɔli̱ die̱l guäc, 4 μg dethalted peptaidni̱ cua kɛ lɛbeli̱d kɛ tandem ma̱th tag (TMT10plex, katalɔg nämbär 90110, Thermö Pi̱ther Thaanytipik) kɛ peptaid ɛ wä kä TMT reagent rɛci̱ö duŋ 1:20. Kɛ kui̱ TMT lɛbeliŋ, 0.8 mg duŋ TMT riejɛnt cua nyɔk kɛ thɔ̱thpɛndiŋ rɛy 70 μl duŋ ani̱ɣai̱dröth ACN, kɛnɛ ɣöö ɛn peptaid ëë ci̱ kööt cua nyɔk kɛ loc rɛy 9 μl duŋ 0.1 M TEAB (tri̱ethi̱lammöniöm baikarbönat), min cua 7 μl duŋ TMT riejɛnt rɛy ACN mat thi̱n. Kä kɔncentrɛciɔn cuɛ tekä 43.75%. Kɛ kɔr minitni̱ ti̱ 60 kä inkubëciɔn, ɛn riakciɔn cua woc kɛ 2 μl duŋ 5% ɣai̱drökthai̱lamin. Kä peptaidni̱ tëë ca lɛbeli̱d cua kɛ ruuli̱, cua kɛ jakä kööt, cua kɛ nyɔk kɛ thɔ̱thpɛndiŋ rɛy 200μl duŋ 0.1% puɔrmik athi̱d (FA), cua kɛ da̱a̱k kä rɛw, kɛ kɔrɛ cua kɛ woc kɛ la̱tdɛ kɛɛ thɛlp-made I̱thtëjTipni̱. Mi̱ la̱tkɛ Ulti̱Mate 3000 alti̱ra ɣai̱ perpömɛn li̱kuid krömatögra̱p (Ulti̱Mate 3000 alti̱ra ɣai̱ perpömɛn li̱kuid krömatögra̱p), kɛl kä nuthä rɛw cua pi̱rɛkciɔn kä 1mm x 150mm Akui̱ti̱ti̱ krömatögra̱pik kɔlöm mi̱ ca thiäŋ kɛ 130Å1.7μm C18 pa̱rti̱kal (NoPi̱w, katalög1309). Thermö Pi̱ther Thaanytipik). Peptaidni̱ ti̱ gööl kɛ ja̱l mi̱ 30μl/min, da̱a̱kɛ kä 1% ɛ wä kä 50% bupper B kɛ minitni̱ ti̱ 85 kɛ stepwise gi̱rɛdiɛn mi̱ 96 minitni̱, ɛ jiɛn kä 50% ɛ wä kä 95% bupper B kɛ minitni̱ 3, kɛ kɔrɛ minitni̱ 8 kɛ 95 % Bupper B; Bupper A ɛ 5% ACN kɛnɛ 10 mM ammöniöm baikarbönat (ABC), kɛnɛ bupper B ɛ 80% ACN kɛnɛ 10 mM ABC. Ruuli̱ pi̱rɛkcini̱ kɛ kɔr minitni̱ da̱ŋ 3 kä mat kɛ rɛy buni̱ rɛw (1 + 17, 2 + 18, ɛkw.) kɛnɛ ɣöö jakɛ kä kööt rɛy ba̱ki̱öm thɛnti̱ri̱puɔɔg.
LC-MS/MS anali̱thi̱th. Kɛ kui̱ i̱thpekti̱römeti̱ri̱ mi̱ di̱i̱t, kä peptaidni̱ (nämbär r119.aq) cua kɛ da̱a̱k kä 25 cm, 75 μm rɛydɛ ɛn dai̱mi̱ti̱r UköPrit anali̱ti̱kal kɔlöm (lɛni̱ objɛktib mi̱ ji̱di̱t, tha̱a̱ŋ nämbärä PF7508250) mi̱ ca riali̱kä kɛ 1.9 μm RepröThil-Pur Cdiöm C12, EASY-nLC 1200 (Thermö Pi̱ther Thaanytipik, Jiɛrmani̱). Kä kɔlöm cua rɔm kä 50°C. Bupperni̱ A kɛnɛ B kɛn kɛ 0.1% puɔrmik athi̱d rɛy pi̱i̱ni̱ kɛnɛ 0.1% puɔrmik athi̱d rɛy 80% ACN, kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱. Peptaidni̱ cua kɛ da̱a̱k kɛ i̱thtɛpwi̱th gi̱rɛdiɛn duŋ 200 nl/min ɛ tokɛ kä 6% ɛ wä kä 31% bupper B kɛ minitni̱ ti̱ 65, kɛnɛ ɛ tokɛ kä 31% ɛ wä kä 50% bupper B kɛ minitni̱ 5. Kä eluted peptaidni̱ cua kɛ die̱l guäc kä Örbi̱trap Puciɔn ma̱th i̱thpekti̱römi̱ti̱r (Thermö Pi̱ther Thaanytipik). Peptaid prekurthɔr m/z thëmdɛ cua la̱t kɛ rethölucin duŋ 120,000 rɛy rɛŋä duŋ 350 ɛ wä kä 1500 m/z. Mi̱ la̱tkɛ 27% nɔrmalaidhed kɔlliciɔn enerji̱, kä prekurthɔr in bumni̱ jɛn kɛ ca̱rji̱ wec mi̱ 2 ɛ wä kä 6 ɛ mi̱ ca kuany kɛ kui̱ enerji̱ mi̱ di̱i̱t C trap di̱thöciëcin (HCD) ki̱li̱bɛj. Kä thaak thärkäl ɛ mi̱ ca la̱th kä 1 s. Kä m/z ba̱li̱ö duŋ peptaid pragmɛn cua thɛm rɛy ai̱ön trap kɛ la̱tdɛ kɛɛ AGC targɛt min tɔt duŋ 5×104 kɛnɛ thaak injɛkciɔn min di̱tni̱ jɛn duŋ 86 ms. Kɛ kɔr kä mëë ca da̱a̱k, ɛn prekurthɔr cua la̱th kä dai̱namik ɣɛkkluciɔn li̱th kɛ 45 s. TMT-lɛbeli̱d peptaidni̱ cua kɛ da̱a̱k kä 50 cm, 75 μm Akklaim PepMap kɔlöm (Thermö Pi̱ther Thaanytipik, katalɔg nämbär 164942), kɛnɛ ɣöth i̱thpekti̱ra cua kɛ die̱l guäc kä Örbi̱trap Lumöth Tribri̱d ma̱th i̱thpekti̱römi̱ti̱r cie Thermö Pi̱ther ekui̱mmepuɔm ɣai̱ Thaanytipik kɛ) (FAIMS) kuak (Thermö Pi̱ther Thaanytipik) lätdɛ kä kɔmpi̱ɛnthecin böltɛji̱ni̱ rɛw nyin -50 kɛnɛ -70 V. MS3 ca kuany kɛ min tekä thi̱nkrönaidhɛciɔn prekurthɔr ɛ mi̱ lät kɛ kui̱ TMT ri̱pɔ̱t ayɔn thi̱knal thëmdɛ. Kä peptaid thɛparɛciɔn cua la̱t kä EASY-nLC 1200, kɛ la̱tdɛ kɛɛ 90% li̱ni̱e̱e̱r gi̱rɛdiɛn eluciɔn, kɛ bupper kɔncentrɛciɔn duŋ 6% ɛ wä kä 31%; bupper A cuɛ tekä 0.1% FA, kɛnɛ bupper B cuɛ tekä 0.1% FA kɛnɛ 80% ACN. Kä anali̱ti̱kal kɔlöm ɛ mi̱ lät kä 50°C. La̱tdɛ FreeI̱thtai̱l (berciɔn 1.6, Thermö Pi̱ther Thaanytipik) kɛ dääk pai̱li̱ min nhiam kɛ mëë ca lar ɛ FAIMS kɔmpi̱ɛnthecin böltɛj.
Prötien ŋi̱e̱cdɛ kɛnɛ kua̱nti̱pi̱këcin. Mi̱ la̱tkɛ jɛ kɛɛl kɛ Andrömeda thärch enji̱n, kä data ni̱ tëë nhiam cua kɛ die̱l guäc kɛ la̱tdɛ kɛɛ MadhKuant berciɔn 1.5.2.8 (https://maxkuant.org/). Ɛ matkɛ nɛmɛ thi̱n kä Cre rekɔmbainathe kɛnɛ YFP thi̱kuɛnthi̱ cua jiek kä Aekuorea biktɔria, peptaid pragmɛn i̱thpekti̱ra cua kɛ go̱r kɛ kui̱ kanönikal thi̱kuɛnthi̱ kɛnɛ ai̱thöpuɔm thi̱kuɛnthi̱ duŋ muɔth repi̱rɛn prötieöm (Prötiome ID UP000000589, cua ka̱m raar kä Yuni̱Pröt rɛy Dhie̱e̱c2. Methiönain ɣɔkdhi̱dɛciɔn kɛnɛ prötien N-terminal atheti̱lɛciɔn cua kɛ la̱th cie ba̱riabɔl mi̱ ca riali̱kä; thi̱thtien karbamöyl methylation cua yiath piny cie mi̱ ca riali̱kä. Kä dai̱jɛciɔn parami̱ti̱ri̱ kɛn cua kɛ la̱th kä "i̱thpethi̱pi̱thi̱ti̱" kɛnɛ "tri̱pthin/P". Kä nämbär in tɔt kä peptaidni̱ kɛnɛ rɛdhɔr peptaidni̱ tin la̱tkɛ kɛ ŋi̱e̱c prötien ɛ 1; kä nämbär in tɔt kä peptaidni̱ tin gööl ɛ 0. Piny kä kɔndi̱ciɔni̱ duŋ peptaid map mi̱ cäät, kä prötien identi̱pi̱këcin rɛt cuɛ tekä 0.01. Kä “Peptid in Rɛwdɛ” min ca la̱th lät. La̱tdɛ “match kam runni̱” opciɔn kɛ naŋdɛ kɛ ŋi̱e̱cni̱ ti̱ ci̱ wä gɔɔyä kam pai̱li̱ ti̱ gööl tëë nhiam. La̱tdɛ LFQ mi̱ni̱ma̱m rɛci̱ö kuën 1 kɛ kui̱ lɛbel-ɣi̱ri̱ kua̱nti̱pi̱këcin (LFQ) (60). Kä LFQ intenthi̱ti̱ ɛ mi̱ ca pi̱ltɛr kɛ kui̱ ba̱liömmi̱ rɛw ti̱ lät rɛy bunä jenötaap kɛl kä thaak kɛl, kɛnɛ ɣöö ɛ ɣɛktrapölɛt kä nɔrmal di̱thti̱ri̱buciɔn kɛ bäärädɛ. 0.3 kɛnɛ ɣöö bɛ wä piny 1.8. La̱tdɛ Pertheuth kɔmpi̱e̱tɛciɔn plathpuɔm (https://maxquant.net/pertheuth/) kɛnɛ R (https://r-pröjek.org/) kɛ di̱l guec kä min ci̱ ben raar kä LFQ. Ɛ dup-rɛw mödɛrɛt t thëm mi̱ bä kä limma thɔpwɛɛr pakɛmɛn cua la̱t kɛ kui̱ latdä dääkä anali̱thi̱th (61). Ɛkplörɛtɔri̱ data anali̱thi̱th ɛ mi̱ la̱tkɛ kɛ la̱tdɛ kɛɛ ggplot, PaktöMineR, paktöɛkthtra, GGalli̱ kɛnɛ pi̱atmap. Kä TMT-bɛth prötieömikni̱ data cua kɛ die̱l guäc kɛ la̱tdɛ kɛɛ MadhKuant berciɔn 1.6.10.43. Gör data ni̱ prötieömikni̱ ti̱ /ka̱n pith kä UniPröt'ä yuman prötieömikni̱ databɛth, min cua ka̱m raar rɛy Tɛɛr(pay bäŋuan) 2018. Kä anali̱thi̱th cuɛ matni̱ ai̱thötɔp puri̱ti̱ kɔrreciɔn paktɔr mëë ca ŋun ɛ ram ëë lätdɛ. La̱tdɛ limma rɛy R kɛ kui̱ latdä dääkä anali̱thi̱th. Kä data ni̱ tëë nhiam, databɛth ëë ca go̱r kɛ min ci̱ ben raar, kɛnɛ data anali̱thi̱th la̱tdɛ kɛnɛ min ci̱ ben raar kɛndiaal cua kɛ tɔ̱w rɛy PrötiömeXchange alliance kɛ rɛy PRIDE pa̱rtnɛr repo̱thi̱töri̱ kɛ data thɛt mi̱ ca ŋic PXD019690.
Pa̱ŋcinal annötɛciɔni̱ la jakɛ anali̱thi̱th kä bum. Kä Ingenuity Pathway Anali̱thi̱th (QIAGEN) tool cua la̱t kɛ jiek riäŋä duŋ pa̱ŋcinal annötɛciɔn täämni̱ nyin data thɛt kä juɔkni̱ 8 (Pi̱guur 1). Rɛydɛ mi̱ ciɛk, ɛn kua̱nti̱tɛtib prötien li̱th min ca jiek kä LC-MS/MS (tandem ma̱th i̱thpekti̱römeti̱ri̱) data anali̱thi̱th ɛ mi̱ la̱tkɛ kɛ pi̱li̱tɛr kri̱teria ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: Muth ma̱thkula̱th ɛ mi̱ ca kuany cie i̱thpethi̱thni̱ kɛnɛ bɛkgi̱rɔɔn, kɛnɛ ɣöö ɛn kategöri̱ nyothɛ P ba̱li̱ö mi̱ ca riali̱kä ɛ Benjamini kɛ kui̱ enri̱cimɛn 0.05 kiɛ mi̱ tɔt ɛ mi̱ ca guic i̱ tekɛ luɔt. Kɛ kui̱ gi̱ra̱pä nɛmɛ, kɛn buɔ̱n da̱ŋ dhie̱e̱c tin te nhial kä buɔ̱n kɛl min tekä P ba̱li̱ö min ca riali̱kä kɛn cua kɛ nyoth. Mi̱ la̱tkɛ t-thɛm ti̱ ŋuan, la̱tdɛ kɛɛ li̱ni̱e̱e̱r buɔ̱th prögi̱ra̱m duŋ i̱thtëj-rɛw duŋ Benjamini, Krieger, kɛnɛ Yekutieli (Q = 5%), thaak-kɔrth prötien ɣɛkprɛciɔn anali̱thi̱th ɛ mi̱ la̱tkɛ kä kandi̱dɛtni̱ tin gɔw tin ca ŋa̱c rɛy buni̱ kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱, kɛnɛ ɣöö ba röw kɛl anali̱thi̱th gööli̱. /Thiɛlɛ mi̱ go̱o̱r ɣöö ba SD mi̱ /ci̱ rɔ gɛr naŋ.
Rɛy kä ɣöö ba min ci̱ ben raar rɛy ŋi̱i̱cä ɛmɛ pa̱a̱r kɛ databɛthni̱ tin ca ka̱m raar kɛnɛ ɣöö ba Venn diagram nööŋ rɛy Thurɛ 1, kɔnɛ cua kua̱nti̱tɛtib prötien li̱th mat kɛ MitöKarta 2.0 annötɛciɔni̱ (24). La̱tdɛ kɛɛ kuak tin te rɛy intɛrnɛtdä Thurɛ Venn Diagram (http://baöinpuɔrmatikni̱.psb.ujɛnt.be/wɛbtooli̱/Venn/) kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ diagram.
Kɛ kui̱ lääri̱ diaal kɛ kui̱ i̱thtathti̱thtikal pröciɛri̱ tin la̱tkɛ kɛ kui̱ prötieömikni̱ anali̱thi̱th, guic thɛkcin in ca mat kä Materiali̱ kɛnɛ Methɔdni̱. Kɛ kui̱ ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ kɔ̱kiɛn diaal, lääri̱ diaal cua kɛ jiek rɛy lɛjɛndä min ca gɔ̱r piny. Ɛni̱ mi̱ ca lɛy kɛ duɔ̱ɔ̱p mi̱ dɔ̱ŋ, data ni̱ diaal cua kɛ lat cie mi̱n ± SEM, kɛnɛ ɣöö i̱thtathti̱thtikal anali̱thi̱thni̱ diaal cua kɛ la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ GraphPad Pri̱dhi̱m 8.1.2 thɔpwɛɛr.
Kɛ kui̱ ŋɔaani̱ tin kɔ̱ŋ tin ba gɔ̱r piny kɛ kui̱ ruac ɛmɛ, guic http://adbances.sciencemag.org/cgi/kɔntɛn/full/6/35/eaba8271/DC1.
Nɛmɛ ɛ wargak mi̱ ca lɛp mi̱ ca da̱a̱k piny ŋuɔ̱tni̱ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, min nhɔk ɣöö ba la̱th lät, ba da̱a̱k kɛnɛ nyɔk kɛ lätni̱ rɛy duɔ̱p mi̱ dɔ̱ŋ, mi̱ ci̱ la̱tdɛ min jɔak /ciɛ kui̱ kä ɣöö ba kɔmmerciali̱ jiek kä min ca lat i̱ la̱tdɛ min nhiam ɛ mi̱ cuŋ. Min na̱ŋkɛ thuɔ̱k thin.
Ŋäc: Kɔn thiëc nɛy ji̱ kärɔa ɛn ɣöö biɛ la̱th kä email address kɛ ɣöö bi ram min ci la̱th lät ŋa̱c ɛn ɣöö go̱ri ɣöö bɛ emaildu nɛn kä /ciɛ spam. /Ci̱ nɛy ɛ bi käp kɛ email addressni̱.
Thiec ɛmɛ lätdɛ kɛ ɣöö ba ji̱ thɛm mi ɛ ji̱n ram mi ci ben kä ba ji̱ gaŋ kä ɣöö biɛ la̱th lät.
Ɛ E. Mötöri̱, I. Atana̱thöb, SMV Kɔcan, K. Pöldh-Dönaɣue, V. Thakthi̱bɛlu, P. Giabali̱thkö, N. Töni̱, J. Puyal, N.-G. Larthɔn
Prötiomikni̱ anali̱thi̱th duŋ di̱thpa̱ŋcinal nio̱rɔni̱ cuɛ nyoth i̱ metɛbölik prögi̱ra̱mni̱ kɛn lätkɛ kɛ ga̱ŋ nio̱rödejenereciɔn.
Ɛ E. Mötöri̱, I. Atana̱thöb, SMV Kɔcan, K. Pöldh-Dönaɣue, V. Thakthi̱bɛlu, P. Giabali̱thkö, N. Töni̱, J. Puyal, N.-G. Larthɔn
Prötiomikni̱ anali̱thi̱th duŋ di̱thpa̱ŋcinal nio̱rɔni̱ cuɛ nyoth i̱ metɛbölik prögi̱ra̱mni̱ kɛn lätkɛ kɛ ga̱ŋ nio̱rödejenereciɔn.
©2020 Aththöciacin Amëri̱ka kɛ kui̱ kä ɣöö ba Thaany rep. cuŋ diaal ca kɛ tɔ̱w. AAAS ɛ ram kɛl kä HINARI, AGORA, OARE, CORUS, CLOCKSS, CrossRep kɛnɛ COUNTER. ThaanyAdbanthni̱ ISSN 2375-2548.