Prötien thɔ̱rtiŋ rɛy thɛkrɛtöri̱ pathway ɛ mi̱ gɔa kɛ rɔm thëll kɔmpa̱rti̱mɛntali̱dhëcin kɛnɛ ɣömiöthtathith thi̱n. Ɛ matkɛ nɛmɛ thi̱n kɛ thɛl-mediated thɔ̱rtiŋ, ɛn la̱t lipidni̱ rɛy kinethin thɔ̱rtiŋ rɛy la̱t thɛkrɛtöri̱ tra̱ni̱thpɔr ɛ thie̱c mi̱ ci̱ cuɔ̱ŋ-kɛ gua̱a̱ mi̱ bäär mi̱ /ka̱nɛ ni̱ loc. Ɛn wa̱nɛ, kɔn la̱tnɛ 3D kɛɛl kɛ ti̱ ŋuan ti̱ tekɛ biɛɛl ti̱ ŋuan-rethölucin ri̱i̱l-tai̱m i̱mëjiŋ kɛ nyuɔ̱thdɛ rɛy bi̱bö min pay thänthei̱dhaid glaiköthai̱lpöthpati̱daili̱nöthi̱tɔl-immöbi̱laidhed prötieni̱ kɛ thɛrami̱d lipid möi̱ti̱ni̱ ti̱ bär ɛlɔ̱ŋ kɛn cua kɛ mat kɛɛl kɛnɛ ɣöö cua kɛ da̱a̱k rɛy endöpla̱thmi̱ ti̱ rɛlrɔ̱ ɛ Net tra̱ni̱thmembrɛme min bä raar kä prötien. Ɛ matkɛ nɛmɛ thi̱n, kɔn cua nyoth ɛn ɣöö bär cɛɛn duŋ therami̱de rɛy endöpla̱thmik retikulum membi̱ran ɛ mi̱ bum kɛ kui̱ kä ɣöö ba thɛlɛkti̱bi̱ti̱ kulɛ da̱a̱k. Ŋi̱i̱cda cuɛ ŋuni̱ min nhiam mi̱ cuŋ rɛy bi̱bö mi̱ nyooth ɣöö ba prötien kargöni̱ da̱a̱k kɛ min tekä lipid cɛɛn lɛŋthi̱ rɛy thɛlɛktib ɣɛkpörth thaytni̱ rɛy thɛkrɛtöri̱ pathway.
Rɛy thëlli̱ yukaryötik, kɛn prötieni̱ tin ca thänthei̱dhaid rɛy endöpla̱thmik retikulum (ER) kɛn kɛ kɔrɛ ba kɛ kulɛ da̱a̱k rɛy ja̱liɛn kɛ rɛy duɔ̱p in wä kɛ kɛ kɛ ɣöö bi̱ kɛ kulɛ cop gua̱a̱th in bi̱ thëllular wä thi̱n (1). Ɛ matkɛ jɛ kä kɔat-mediated thɔ̱rtiŋ, jɛn cua lat kɛ gua̱a̱ mi̱ bäär i̱ tha̱a̱ŋ lipidni̱ de kɛn lät cie thɛlɛktib ɛki̱th puɔɔni̱ ɛ matkɛ kɛ rɛy membi̱ran dɔmiɛni̱ ti̱ caa lɛy tin la prötieni̱ ti̱ caa lɛy (2-5). Cieŋni̱ min, cuɛ ŋot ɛ mi̱ thiɛl dai̱rɛkt rɛy bi̱bö evidence mi̱ nyoth ɣöö nɛmɛ derɛ rɔ lot kɛ lipid-bɛth mekani̱dhi̱öm. Rɛy kä ɣöö ba riɛk ɛmɛ min thi̱a̱k kulɛ luäŋ kɛ wuɔ̱c, cua kɔ ŋi̱e̱e̱c rɛy yi̱th i̱ glaiköthi̱lpöthpatidai̱linöthitɔl (GPI) ankɔred prötieni̱ (GPI-APni̱) kɛn kɛ dääk mi̱ naŋkɛ raar kä ER. GPI-APni̱ kɛn kɛ lipid-kɔnekted thëll thɔ̱rpëth prötieni̱ ti̱ gööl (6, 7). GPI-AP ɛ prɔti̱i̱n mi̱ caa ka̱m raar mi̱ caa mat kä warɛgakni̱ tin tä raar kä pla̱thma̱ mɛmbɛrɛn kɛ rɛy glaikɔlipi̱d möieti̱ (GPI ankɔr). Kɛn cukɛ GPI ankɔri̱ nhɔk cie kɔntherbɛtip pöth-tra̱ni̱thlɛciɔnal mödi̱pi̱këcini̱ rɛy ER lumen (8). Kɛ kɔr kä mëë caa mat, ɛn GPI-AP laa wɔ̱ kɛ rɛy Gölgi̱ apparata̱th (5, 9) ɛ jiɛn kä ER ɛ wɔ̱ ni̱ kä pla̱thma̱ mɛmbɛrɛn. Kä ta̱a̱ GPI ankɔri̱ thi̱n la GPI-AP ɛ jakä naŋɛ jɛ ɛ la mi̱ göl kä tra̱ni̱thmembi̱ran prötieni̱ tin ca woc (cu määni̱ pla̱thma̱ membi̱ran prötieni̱ kɔ̱kiɛn) ɛ wä bäär kä duɔ̱ɔ̱p in wä kɛ thi̱n (5, 9, 10). Rɛy yi̱th thëlli̱, GPI-APni̱ kɛn cua kɛ da̱a̱k kä prötieni̱ kɔ̱kiɛn tin ca woc rɛy endöpla̱thmik retikula̱m, kɛ kɔrɛ cua kɛ mat rɛy bɛthikɔli̱ ti̱ gööl ti̱ ca kum ɛ kɔt prötien kɔmpi̱lɛk II (COPII) (6, 7). Kä tin no̱o̱ŋ dääk ɛmɛ rɛy ER ɛkpörth prötheth kɛn /ci̱kɛ jɔc, duŋni̱ ɣöö jɛn cua lat i̱ mekani̱dhi̱öm ɛmɛ dɔ̱ŋ bɛ lipidni̱ go̱r, ɛlɔ̱ŋ i̱thtra̱kciɛral ri̱mödɛliŋ duŋ lipid tha̱a̱ŋdɛ duŋ GPI ankɔr (5, 8). Rɛy yi̱th, GPI lipid ri̱mödɛliŋ tuɔk kɛ jɛ niɛ gua̱a̱th ɛmɔ kɛ kɔr kä mëë ci̱ GPI rɔ mat, kɛnɛ ɣöö rɛy gua̱thni̱ ti̱ ŋuan, jɛn bɛ thɛrami̱d jakä ɣöö bɛ rɔ mat kä 26-karbön lɔɔŋ-cɛɛn tha̱turated pɛtti̱ athi̱d (C26:0) (11, 12). C26 thɛrami̱d ɛ jɛn thɛrami̱d in di̱tni̱ jɛn min la̱tkɛ ɛ yi̱th thëlli̱ ɛ wä ni̱ täämɛ. Jɛn ɛ mi̱ ca thänthei̱dhi̱ rɛy ER kɛnɛ ɣöö ri̱wdɛ cua naŋ raar kä Gölgi̱ apparata̱th kɛ rɛy COPII bɛthikɔli̱ (13). Kä ER ɛkpörth duŋ GPI-AP lotdɛ ni̱ ɣöö go̱o̱rɛ thɛrami̱d thänthethi̱th mi̱ lät rɔ (14, 15), kɛnɛ ɣöö kɛ kɔrɛ, ɛn gër thɛrami̱d ɛ wä kä inöthitöl pöthpët thɛrami̱d (IPC) rɛy Gölgi̱ apparata̱th cuɛ tekä GPI ankɔr thänthethi̱th (16). Ŋi̱i̱cni̱ baöpi̱i̱dhi̱kal kɛ arti̱pi̱cial membi̱rani̱ cuɛ nyoth i̱ athi̱l cɛɛn theramaidni̱ mi̱ bäär ɛlɔ̱ŋ bɛ rɔ mat kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ dɔmiɛni̱ ti̱ ca guir kɛ ciɛŋ pi̱dhikal ti̱ gööl (17, 18). Data ni̱ ti̱ti̱ cukɛ bo̱thni̱ ɣai̱pöthethi̱th min C26 theramide kɛnɛ GPI-AP kɛ C26 theramide lät kɛn kɛ ciɛŋ pua̱nykiɛn kɛ römdiɛn rɛy gua̱thni̱ ti̱ ca guir kiɛ gua̱th tin te rɛy ER membran lipid enba̱rɔnmɛn mi̱ ci̱ rɔal. Jɛn di̱tdɛ ɛlɔ̱ŋ kä tekɛ gi̱lai̱thɛrölipi̱dni̱ ti̱ ciɛwciɛw kɛnɛ ti̱ /ci̱ thi̱a̱a̱ŋ (C16:1 kɛnɛ C18:1) (19, 20). Kɛn ri̱jini̱ ti̱ti̱ ba kɛ kulɛ kuany kɛ gua̱a̱th in bi̱ ER ben raar thi̱n (ERES), gua̱th in bi̱ thɛrami̱de kɛnɛ thɛrami̱de-bɛth GPI-AP bi̱ kɛn ɛ naŋ kɛɛl ɛ wä kä Gölgi̱ rɛydɛ ɛn COPII bɛthikɔl (5) in ca lɛy.
Rɛy ŋi̱i̱cä nɛmɛ, kɔn cua lipid-bɛth mekani̱dhi̱öm ɛmɛ ɣɔ̱n ɛ jɔc kɛ la̱tdɛ kɛɛ thuper-rethölucin kɔnpökal rial-tai̱m i̱mëjiŋ mai̱kröthkɔɔpi̱ (SCLIM), min la ca̱p mai̱kröthkɔɔpi̱ mi̱ ca ŋok-ɛdge min bi̱ guic kɛɛl kɛ pluorethɛnli̱ lɛbeli̱d prötieni̱ Kä bi̱ɛɛl-diɔ̱k kɛnɛ dai̱mɛncinal-diɔ̱k tin tekɛ lipelu mi̱ di̱i̱t rɛydɛ (3D) (21, 22).
Cu nɛy SCLIM tɛknölöji̱ la̱th lät kɛ nhiam kɛ latdɛ i̱ nɔrmal GPI-AP kɛ C26 theramide buɔ̱n cua i̱thkri̱ni̱ŋ kä tra̱ni̱thmembi̱ran thɛkrɛted prötieni̱ kɛ kɔr kä mëë cɛ ER ba̱ny piny rɛy S. therebi̱thiae. Rɛy kä ɣöö ba ER da̱a̱k, kɔn cua la̱t kɛ jenetik thi̱thtɛm min bi̱ guic ɛ jɔc ɛn kargö min pay thänthei̱dhaid min wä rɛy ERES rɛy bi̱bö (7, 23). Cie kargö, cua C26 theramade-bɛth GPI-AP Ga̱th1 lɛbeli̱d kɛ gi̱ri̱i̱n pluorethɛn prötien (GFP) kɛnɛ tra̱ni̱thmembi̱ran thɛkrɛted prötien Mid2 lɛbeli̱d kɛ near-inpa̱rɛd pluorethɛn prötien (iRFP), kɛn da̱ŋ rɛw targɛtkɛ pla̱thma̱ membɛrɛn (24-26). Rɛy thɛk31-1 lëth-thɛnthi̱tib mutant, kɛn kargöni̱ rɛw ti̱ti̱ cua kɛ nyoth piny galaktöth-inda̱kthi̱bɔl prömötɛr kɛnɛ kɔni̱thti̱ti̱ötip ERES markɛr. Kä lëth in di̱tni̱ jɛn (37°C), kɛ ɣöö ɛn sec31-1 mutɛciɔn bɛ la̱t duŋ COPII kɔat kɔmpönɛnt Sec31 ya̱r kɛ ga̱ŋ COPII pi̱e̱th kɛnɛ ER ɣɛkpörth, thänthei̱dhaid kargö mi̱ ji̱di̱t bɛ rɔ dol kä ER (23). Kɛ kɔr kä mëë ci̱kɛ kɔ̱c ɛ wä kä lëth mi̱ tɔt (24°C), kä sec31-1 mutant thëlli̱ cukɛ rɔ̱ luäŋ kɛ jiëc rɛy gua̱th in te thɛkrɛtöri̱ thi̱n, kɛnɛ ɣöö cua thi̱nthethtik kargö mi̱ ji̱di̱t ruɔ̱ɔ̱l tok kɛ naŋdɛ raar kä ER. CLIM bithuali̱dhëcin cuɛ nyoth i̱ ri̱w kä tin pay thänthei̱dhaid Gath1-GFP kɛnɛ Mid2-iRFP ŋotdɛ cukɛ rɔ̱ dol rɛy ER duŋ sec31-1 mutant thëlli̱ kɛ kɔr inkubëciɔn kä 37°C kɛnɛ ɣöö kɛ kɔrɛ cua kɛ lony kä 24°C kɛ minitni̱ 5 (Pi̱guur 1). Ni̱ mëë Mid2-iRFP cuɛ däk piny kä ER membi̱ran kɛɛliw, kɛnɛ ɣöö Gath1-GFP cuɛ te thi̱n kɛnɛ ɣöö cuɛ rɔ dol rɛy gua̱th ER membɛrɛnä min /ci̱ rɔ gɛr, dääkdiɛn cuɛ tekɛ dääk mi̱ di̱i̱t (Pi̱guur 1, A ɛ wä kä C kɛnɛ Mubi S1). Ɛ nyɔk bä, cie min ca nyoth rɛy Thurɛ 1D, ɛn Ga̱th1-GFP buɔ̱n thiɛlɛ jɛ Mid2-iRFP. Ti̱ti̱ ci̱ ben raar cua nyoth i̱ GPI-AP kɛnɛ tra̱ni̱thmembi̱ran prötieni̱ cua kɛ da̱a̱k rɛy ER membi̱ran ri̱jini̱ ti̱ gööl kɛ nhiam. Kä Ga̱th1-GFP ki̱la̱thtɛr ɛ mi̱ thi̱ääk kɛ ERES mi̱ ca lɛy mi̱ ca lɛbeli̱d kɛ mCɛri̱'ä COPII kɔat prötien Thec13 (Pi̱guur 1, E kɛnɛ F, kɛnɛ muubi S1) (23).
thec31-1 thëlli̱ la kɛn galaktöth-indɔktid thɛkrɛciɔni̱ ɛ nyoth, ɛ lɔɔŋ athi̱l cɛɛn (C26) therami̱d GPI-AP Ga̱th1-GFP (GPI-AP, mi̱ tɔ̱c) kɛnɛ tra̱ni̱thmembi̱ran prötien Mid2-iRFP (TMP, mi̱ yie̱l) kɛnɛ ɣöö nɛmɛ Kɔni̱thtra̱ktip ERES lɛbeliŋ Thek13-mCerri̱ cua at30 minitni̱, cua naŋ kä 24°C, kɛnɛ ɣöö cua thurɛdɛ la̱th ɛ SCLIM minitni̱ 5 kɛ kɔrɛ. (A ɛ wä kä C) nyothɛ mi̱ cuŋ ɛ la mi̱ ca mat kiɛ thurɛ 2D kɛl kä pi̱lɛɛn(A),ɛ 2D pöröjɛkcin thurɛ duŋ 10 z-thɛkcini̱(B) kiɛ ɛ 3D thëll ɣemi̱thpi̱e̱r thurɛ duŋ kargö kɛnɛ ERES markɛri̱(C). I̱thkiɛl bar 1μm(A kɛnɛ B). Kä i̱thkiɛl yunit ɛ 0.551μm(C). Gath1-GFP cua jiek rɛy ER ri̱jini̱ ti̱ gööl kiɛ buɔ̱n, niɛ gua̱a̱ mɔ cua Mid2-iRFP jiek kɛnɛ ɣöö cua da̱a̱k rɛy ER membran (C) kɛɛliw. (D) Kä gi̱ra̱p nyothɛ ri̱lɛtib pluorethcen intenthi̱ti̱ duŋ Ga̱th1-GFP kɛnɛ Mid2-iRFP rɛy Ga̱th1-GFP ki̱la̱thtɛr ɛ wä bäär kä arröw lany mi̱ bo̱r (caam). AU, ɛ arbi̱trɛri̱ yunit. (E kɛnɛ F) cuŋkɛ ɛ la thurɛ 3D min mat kuak kɛnɛ ERES mark. Ga̱th1-GFP ki̱la̱thtɛri̱ cua kɛ jiek thi̱ääkä ERES mi̱ ca lɛy. Kä i̱thkiɛl yunit ɛ 0.551μm. (F) Kä thölid arröw mi̱ bo̱r nyoothɛ Ga̱th1-GFP ki̱la̱thtɛr mi̱ thi̱ääk kɛ ERES. Kä panɛli̱ tin te däär kɛnɛ kui̱c cuëëc nyothkɛ thurɛ 3D mi̱ ca mat kɛɛl kɛnɛ guäcdɛ min ca ri̱et kä Ga̱th1-GFP ki̱la̱thtɛr min ca kuany.
Kä maar in thi̱a̱k kam Ga̱th1-GFP ki̱la̱thtɛr kɛnɛ ERES mi̱ ca lɛy cuɛ nyoth i̱ Ga̱th1-GFP bɛ wä rɛy thɛlɛktib ERES, min tekɛ dääk kɛ thɛlɛkti̱bi̱ti̱ min lät ɛ Mid2-iRFP kɛ ba̱nydɛ piny kä ER. Mi̱ görkɛ ɣöö ba nɛmɛ ŋa̱c, cua ERES rɛci̱ö kuɛn kɛ kui̱ kuakni̱ kɛl kiɛ rɛw kärɔ̱ (Pi̱guur 2, A ɛ wä kä C). Cuɔ̱kɔ jɛ jek ɛn ɣöö ERES ti̱ ŋuan (70%) tekɛ kɛɛ kargö kɛl kärɔa. Kä thurɛ min te piny kä Thurɛ 2C nyothɛ cäätni̱ rɛw ti̱ ŋa̱ckɛ kä ERES kɛ Gath1-GFP kärɔa (Pi̱guur 1) kiɛ Mid2-iRFP kärɔa (Pi̱guur 2). Mi̱ gua̱c, ɛn 20% kä ERES tëkɛ kuak da̱ŋ rɛw ti̱ ci̱ rɔ̱ mat rɛy gua̱th mi̱ cäät. Cua jiek ɛn ɣöö tha̱a̱ŋ ERES (10%) tekɛ kuak da̱ŋ rɛw ti̱ ca naŋ, duŋni̱ ɣöö cua kɛ da̱a̱k rɛy gua̱thni̱ ti̱ gööl ti̱ jɔc. Kɛ kui̱c ɛmɔ, ɛn i̱thtathti̱thtikal anali̱thi̱th ɛmɛ nyothɛ jɛ i̱ kɛ kɔr kä mëë ca ER naŋ raar, GPI-AP Gath1-GFP kɛnɛ tra̱ni̱thmembi̱ran kargö Mid2-iRFP kɛn cua kɛ da̱a̱k kä ERES ti̱ gööl (Pi̱guur 2D). Ɛn thɔ̱rtiŋ ɛmɛ ɛ mi̱ ci̱ rɔ lot ɛlɔ̱ŋ kɛ baökemikal anali̱thi̱th ëë nhiam (6) kɛnɛ mörpölöji̱kal determinɛciɔn (7). Kɔn bä dënɛ ta̱a̱ ciɛŋä kargö min ca la̱th rɛy kuarantin guic min wä rɛy ERES (Pi̱guur 2E kɛnɛ Mubi S2). Thurɛ 2E nyothɛ jɛ i̱ ɛ tha̱a̱ŋdɛ mi̱ tɔt kärɔa kä Gath1-GFP (panɛl 3) kiɛ Mid2-iRFP (panɛl 4) cuɛ wä rɛy ERES ɛ jiɛn kui̱c kɛl kɛnɛ ɣöö cua yian rɛy gua̱th mi̱ ca da̱a̱k. Panɛl 5 kä Thurɛ 2E nyothɛ jɛ ɛn Gath1-GFP kɛnɛ Mid2-iRFP kɛ tha̱a̱ŋ gua̱thni̱ la jiëkɛ rɛy ERES mi̱ cäät, duŋni̱ ɣöö kɛn wä kɛ rɛy gua̱thni̱ ti̱ gööl kɛnɛ ɣöö kɛn cukɛ te rɛy gua̱thni̱ ti̱ gööl tin dɔ̱ŋ cuŋ ɛ la COPII bɛthikɔli̱ ti̱ gööl. Cu nɛy ɛ ŋa̱c bä ɛn ɣöö ca guic ɛ la dääk kɛnɛ dääk duŋ C26 theramade-bɛth GPI-AP Ga̱th1 cie thɛlɛktib ERES ɛ mi̱ ca lɛy kɛ ɣöö tra̱ni̱thmembi̱ran thɛkrɛciɔn kargö dɔ̱diɛn, kä GFP-tagged pla̱thma̱ membran prötien Axl2 (27), nyothɛ ciɛŋ ti̱ cäät kɛ Mid2-iRFP. (Thurɛ S1 kɛnɛ Muubi S3). Kä Axl2-GFP min pay thänthei̱dhaid ɛ mi̱ ca da̱a̱k rɛy ER membi̱ran ce̱tkɛ Mid2-iRFP (Pi̱guur S1, A kɛnɛ B), kɛnɛ ɣöö ɛ co-lökalaidhed kɛ Mid2-iRFP rɛy ERES ti̱ ŋuan (Pi̱guur S1, B ɛ wä kä D). Panɛli̱ 1 kɛnɛ 2 kä Thurɛ 1. S1C nyothɛ cäätni̱ rɛw ti̱ ŋa̱ckɛ kä ERES gua̱th in ci̱ tra̱ni̱thmembi̱ran kargöni̱ rɛw rɔ̱ mat thi̱n. Rɛy gua̱thni̱ ti̱ti̱, kɛn kuak da̱ŋ rɛw wä kɛ rɛy ERES kɛɛl (Pi̱guur S1E, Panel 3 kɛnɛ Mubi S3).
Kä thɛk31-1 thëlli̱ nyothkɛ galaktöth inda̱kthi̱bɔl thɛkrɛciɔni̱, Ga̱th1-GFP (GPI-AP, mi̱ tɔ̱c) kɛnɛ Mid2-iRFP (TMP, mi̱ yie̱l) kɛnɛ kɔni̱thti̱ti̱ötip ERES lɛbeliŋ Thek13-mCɛri̱ (ERES, magenta) cua kɛ la̱th kä 37 Kɛ kɔr kä mëë ca inkubɛtiŋ ɛ wä kä °C ɛ wä kä 30 minitni̱ möbe. bɔlɔk, kɛnɛ thurɛ min tekɛ SCLIM kɛ kɔr minitni̱ da̱ŋ 20. (A ɛ wä kä C) Cuŋkɛ ɛ la 2D pöröjɛkcin thurɛni̱(A;i̱thkiɛl bar,1μm) kiɛ 3D thëll ɣemi̱thpi̱e̱r thurɛni̱(B kɛnɛ C;i̱thkiɛl yunit,0.456μm) duŋ kargö kɛnɛ 10 z-thɛkcini̱ ti̱ ca nyoth ɛ ERES. Kä panɛl in te piny rɛy (B) kɛnɛ panɛl rɛy (C) nyothkɛ thurɛni̱ tin ca la̱t kɛ nyuɔ̱th ŋɔaani̱ kärɔ̱ tin te rɛy ERES (majɛnta) [Ga̱th1-GFP (mi̱ tɔ̱c) kɛnɛ Mid2-iRFP (mi̱ yie̱l mi̱ buay)]. (C) Arröw mi̱ ca lɛp: ERES la naŋɛ ni̱ kuak kɛl kärɔa (1 ɛ wä kä 4). Grey arröw: ERES tëkɛ kargö mi̱ ca da̱a̱k (5). Arröw mi̱ bo̱r: ERES min tekɛ kargö mi̱ ca mat kɛɛl. Piny: Kä ERES kɛl min ca kuany tëkɛ Ga̱th1-GFP (1) kiɛ Mid2-iRFP (2) kärɔa. I̱thkiɛl bar, 100 nm. (D) Kuanti̱pi̱këcin duŋ pötömai̱krögra̱p min ca lat rɛy (C). Kä aberig perthäntig duŋ ERES min tekɛ kargö kɛl kärɔa (Ga̱th1-GFP kiɛ Mid2-iRFP), kargö mi̱ ca da̱a̱k kɛnɛ kargö mi̱ ci̱ rɔal. Rɛy ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ diɔ̱k ti̱ cuŋ kärɔ̱, n=432 rɛy thëlli̱ 54. Ɛrrɔr bar = SD. T thëm t mi̱ /thiɛl rɛw mi̱ tekɛ juɔ̱l. *** P = 0.0002. (E) 3D thurɛ min ca kuany kä ERES duŋ kargö min ca la̱th gua̱a̱th kɛl min ca gɔ̱r kɛ (C). Ga̱th1-GFP (mi̱ tɔ̱c) (3) kiɛ Mid2-iRFP (mi̱ yie̱l) (4) cuɛ wä rɛy ERES (majɛnta) ɛ jiɛn kui̱c kɛl kɛnɛ ɣöö cua gaŋ ɛ la gua̱a̱th mi̱ tɔt rɛydɛ ɛn ERES. Tha̱a̱ŋ gua̱thni̱, kɛn kargöni̱ da̱ŋ rɛw la wä kɛ rɛy ERES mi̱ cäät (5) ɛ jiɛnkɛ kui̱c kɛl kä ba kɛ yiɛn gua̱a̱th mi̱ ca lɛy rɛy ERES. I̱thkiɛl bar, 100 nm.
Kɛ kɔrɛ, cua ɣai̱pöthethi̱th ɣɔ̱n min la lɔɔŋ athi̱l cɛɛn theramide (C26) min te rɛy ER membi̱ran min no̱o̱ŋ ɣöö bɛ rɔ mat kɛɛl kɛnɛ kuën Ga̱th1 rɛy thɛlɛktib ERES. Kɛ guutdɛ, cua yi̱th i̱thtrain mi̱ ca riali̱kä GhLag1 la̱t, rɛydɛ ɛn endöjeni̱öth thɛramide thi̱nthatheth Lag1 kɛnɛ Lac1 cua kɛ gɛr ɛ GhLag1 (kä Lag1 ɣömölög duŋ kɔttɔn), cuɛ ben raar ɛ la yi̱th i̱thtrain kɛ thëll membɛrɛn Theramide i̱thtrain mi̱ ciɛk mi̱ läny ta̱a̱ dɔaar (Pi̱guur 3A) (2). Ma̱th i̱thpekti̱römeti̱ri̱ (MS) anali̱thi̱th cuɛ nyoth i̱ rɛy wäld-taap i̱thtrainni̱, 95% kä mat thɛrami̱de ɛ mi̱ bäär ɛlɔ̱ŋ (C26) cɛɛn thɛrami̱d, niɛ gua̱a̱ mɔ rɛy GhLag1, 85% kä thɛrami̱d ɛ mi̱ bäär ɛlɔ̱ŋ (C18 kɛnɛ C16). ), kärɔa 2% kä thɛrami̱d ɛ mi̱ bäär ɛlɔ̱ŋ (C26) cɛɛn thɛrami̱d. Cieŋni̱ min C18 kɛnɛ C16 thɛrami̱dni̱ kɛn kɛ thɛrami̱dni̱ tin di̱t tin ca jiek rɛy GhLag1 membɛrɛn ɛ wä ni̱ täämɛ, MS anali̱thi̱th bä cuɛ nyoth i̱ GPI ankɔr duŋ Ga̱th1-GFP cuɛ nyoth rɛy GhLag1 i̱thtrain tëkɛ C26 thɛrami̱d, min päär kɛ wild-taap lipidni̱. Kä gɔɔydɛ ɛ mi̱ cäät (Pig. 3A) (26). Kɛ kui̱c ɛmɔ, nɛmɛ lotdɛ ni̱ ɣöö ɛn therami̱d ri̱mödɛliŋ endhɛm Cwh43 ɛ mi̱ ca kuany ɛlɔ̱ŋ kɛ kui̱ C26 therami̱d, cie min ca nyoth rɛy Thurɛ 26, jɛn cuɛ nhɔk ni̱ ɣöö bɛ GPI ankɔr mat thi̱n ɛ jiɛn kä pek mi̱ tɔt kä C26 theramid rɛy GhLag1 i̱thtrain. S2(29). Cieŋni̱ min, ɛn thëll membi̱ran duŋ GhLag1 bɛthikali̱ tëkɛ C18-C16 theramaid kärɔa, niɛ gua̱a̱ mɔ Gath1-GFP cuɛ ŋot tekɛ C26 theramaid. Thuɔ̱k ɛmɛ cuɛ i̱thtrain ɛmɛ jakä kuak ti̱ gɔw kɛ riali̱ rikni̱ kä athi̱l cɛɛn lɛŋthi̱ duŋ membi̱ran thɛramid rɛy ER. Kä la̱t ɣai̱pöthethtikal duŋ ki̱lɛthä kɛnɛ kuëndiɛn. Kɛ kɔrɛ, cua kɔ ŋi̱e̱e̱c kɛ nhiam kɛ lua̱ŋ duŋ C26 Ga̱th1-GFP kɛ ruuli̱dɛ rɛy buni̱ rɛy GhLag1 kɛ lëth-thɛnthi̱tib mutant allële duŋ sec31-1 kɛ rɛy kɔnbenciɔnal pluorethcen mai̱kröthkɔɔpi̱, gua̱th in bi̱ bäär kärɔa (C18-C16) cɛɛn te thi̱n rɛy ER membran Theramide (Pig. 3). Cu nɛy ɛ guic ɛn ɣöö rɛy thɛk31-1, ri̱w Gath1-GFP cuɛ te rɛy buni̱, niɛ gua̱a̱ mɔ Gath1-GFP rɛy thɛk31-1 GhLag1 kɛ bäär (C18-C16) bäär thɛrami̱d ER membɛrɛn cuɛ di̱t ɛlɔ̱ŋ kä /cɛ te kɛɛl kɛnɛ ɣöö cuɛ däk piny rɛy ER membɛrɛn kɛɛliw. Mi̱ görkɛ ɣöö ba ŋa̱c ɛ gɔaa, kɛ ɣöö C26 ceramide-bɛth ki̱la̱thtɛriŋ ɛ mi̱ thi̱ääk kɛ ERES mi̱ ca lɛy (Pi̱guur 1), cua kɔ nyɔk kɛ di̱e̱l guäc mi̱ ɛn la̱t ɛmɛ dɔ̱ŋ bɛ tekɛ la̱t duŋ ER ɣɛkpörth prötien mekani̱dhi̱öm. GPI-AP lätdɛ kɛɛ COPII thi̱thtɛm mi̱ rɛlrɔ kɛ kui̱ ER ɛkpörth, min lät ɛ la mi̱ ca guir ɛ Ted1's i̱thtra̱kciɛral ri̱mödɛliŋ duŋ glaikan tha̱a̱ŋ GPI ankɔr (30, 31). Kä rekɔmbainan GPI-glaikan kɛ kɔrɛ ba cu ŋic ɛ tra̱ni̱thmembi̱ran kargö ri̱thɛptɔr p24 kɔmpi̱lɛk, min bi̱ rɔ ri̱t ɛ thɛlɛkti̱bi̱li̱ bɛ Lst1 naŋ, min la ai̱thöpuɔm mi̱ ca lɛy kä min di̱i̱t kä COPII kargö baindiŋ tha̱buni̱t Thec24, bɛ cu ben ɛ la GPI-AP-ri̱c COPII Bɛthi̱kali̱ kɛn ti̱ görkɛ (31). Kɛ kui̱c ɛmɔ, cua mutant mi̱ rɛwdɛ la̱t min cu mat kɛ wuɔ̱c prötieni̱ ti̱ti̱ kɛl (kä p24 kɔmpi̱lɛk kɔmpönɛnt Emp24, GPI-glaikan ri̱mödɛliŋ endhɛm Ted1 kɛnɛ min ca lɛy kä COPII tha̱buni̱t Lst1) kɛ thɛk31-1 mutant i̱thtrain, kɛnɛ ɣöö cua kɛ ŋi̱e̱e̱c Ɛ mi̱ de rɔ lot kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ Ga̱thtɛr GFP1-clu3). Cu nɛy ɛ guic ɛn ɣöö rɛy thek31-1emp24Δ kɛnɛ thek31-1ted1Δ, Ga̱th1-GFP ɛ mi̱ di̱i̱t mi̱ /ka̱n mat kɛɛl kɛnɛ ɣöö cɛ da̱a̱k rɛy ER membi̱ran kɛɛliw, cie mëë ca nɛn ni̱ wal rɛy thek31-1 GhLag1, niɛ gua̱a̱ mɔ rɛy thek31-1lst1Δ, Ga̱th1-GFP1 Ce̱tkɛ thek3. Ti̱ti̱ ci̱ ben raar cua nyoth i̱ rɛydɛ matdɛ ni̱ ɣöö te C26 theramide thi̱n rɛy ER membi̱ran, kä buɔ̱n Gath1-GFP bä go̱o̱rɛ ɣöö bɛ rɔ yiath kä p24 kɔmpi̱lɛk, kɛnɛ ɣöö /cɛ Lst1 mi̱ ca lɛy go̱r i̱ ba naŋ. Kɛ kɔrɛ, cua kɔn guic i̱ derɛ rɔ lot ɛn ɣöö bi̱ cɛɛn lɛŋthi̱ duŋ therami̱de rɛy ER membi̱ran bɛ mat Gath1-GFP ɛ wä kä p24 riali̱kä. Cieŋni̱ min, cua jiek ɛn ɣöö ta̱a̱ C18-C16 therami̱de rɛy membi̱ran /cɛ GPI-glaikanni̱ tin ca nyɔk kɛ lätni̱ ɛ p24 kɔmpi̱lɛk (Pi̱guri̱ S3 kɛnɛ S4, A kɛnɛ B) kiɛ matdɛ kɛɛ GPI-AP kɛnɛ ja̱lɛ GPI-AP. lua̱ŋ. Rekrut COPII tha̱btaap Lst1 (Pi̱guur S4C). Kɛ kui̱c ɛmɔ, C26 ceramide-dipɛndɛnt ki̱la̱thtɛriŋ /cɛ prötien interɛkcini̱ go̱r kɛ ER ɣɛkpörth prötien mekani̱dhi̱ömni̱ ti̱ gööl, duŋni̱ ɣöö luäkɛ altɛrnatip thɔ̱rtiŋ mekani̱dhi̱öm min nööŋkɛ ɛ lipid lɛŋthi̱. Kɛ kɔrɛ, cua kɔn die̱l guäc mi̱ ɛn thɛrami̱d athi̱l cɛɛn lɛŋthi̱ rɛy ER membi̱ran ɛ mi̱ gɔa kɛ kui̱ kä ɣöö ba Ga̱th1-GFP da̱a̱k ɛ gɔaa cie thɛlɛktib ERES. Ni̱ mëë Ga̱th1 rɛy GhLag1 i̱thtrain kɛ thɔ̱rt-cɛɛn theramade cuɛ ER ba̱ny piny kɛnɛ ɣöö bɛ wä rɛy pla̱thma̱ membɛrɛn (Pi̱guur S5), kɔn ŋa̱thnɛ jɛ mi̱ ca thɔ̱rtiŋ ɛ naŋ ɛ bär theramade athi̱l cɛɛn, ɛn Ga̱th1 rɛy GhLag1 i̱thtrain dɔ̱ŋ bɛ rɔ ri̱t kɛnɛ ɣöö bɛ cu gɔ̱k. ERES kuak tin tekɛ membi̱ran mi̱ cäät.
(A) Kä thëll membi̱ran duŋ GhLag1 cuɛ di̱t ɛlɔ̱ŋ kä tekɛ C18-C16 theramaidni̱ ti̱ ciɛk, niɛ gua̱a̱ mɔ ɛn GPI ankɔr duŋ Ga̱th1-GFP cuɛ ŋot kɛ mi̱ tekɛ C26 IPC mi̱ cäät cie wäld-taap thëlli̱. Nhial: athi̱l cɛɛn lɛŋthi̱ anali̱thi̱th duŋ theramaid rɛy thëll membi̱ran duŋ wild-taap (Wt) kɛnɛ GhLag1p i̱thtrainni̱ ɛ ma̱th i̱thpekti̱römeti̱ri̱ (MS). Kä data ni̱ cuŋkɛ ɛ la perthäntig duŋ therami̱de kɛɛliw. Kä aberig duŋ ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ diɔ̱k ti̱ cuŋ kärɔ̱. Ɛrrɔr bar = SD. T thëm t mi̱ /thiɛl rɛw mi̱ tekɛ juɔ̱l. **** P <0.0001. Panɛl in te piny: MS anali̱thi̱th duŋ athi̱l cɛɛn lɛŋthi̱ duŋ IPC min te rɛy Ga̱th1-GFP (GPI-IPC) GPI ankɔr min ca nyoth rɛy wild-taap kɛnɛ GhLag1p i̱thtrainni̱. Kä data ni̱ cuŋkɛ ɛ la perthäntig duŋ IPC thi̱knal kɛɛliw. Aberig duŋ ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ dhie̱e̱c ti̱ cuŋ kärɔ̱. Ɛrrɔr bar = SD. T thëm t mi̱ /thiɛl rɛw mi̱ tekɛ juɔ̱l. ns, /cɛ gɔaa. P=0.9134. (B) Pluorethcen mai̱krögra̱pni̱ duŋ thek31-1, thek31-1 GhLag1, thek31-1emp24Δ, thek31-1ted1Δ kɛnɛ thek31-1lst1Δ thëlli̱ ti̱ nyooth galaktöth-indɔktid Ga̱th1-GFP cua kɛ inkubɛted piny kä 37 minutethköre kɛ kɔr 24°C. Arröw mi̱ bo̱r: ER Ga̱th1-GFP ki̱la̱thtɛr. Ɣɔpɛn arröw: Ga̱th1-GFP mi̱ /ka̱n mat kɛɛl ɛ mi̱ ca da̱a̱k kä ER membi̱ran kɛɛliw, nyothɛ ciɛŋ ER ni̱kli̱e̱e̱r riŋ i̱thtɛniŋ. I̱thkiɛl bar, 5μm. (C) Kuanti̱pi̱këcin duŋ pötömikrögra̱p min ca lat rɛy (B). Kä aberig perthäntig duŋ thëlli̱ kɛ punktɛt Ga̱th1-GFP i̱thtra̱kciɛr. Rɛy ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ diɔ̱k ti̱ cuŋ kärɔ̱, n≥300 thëlli̱. Ɛrrɔr bar = SD. T thëm t mi̱ /thiɛl rɛw mi̱ tekɛ juɔ̱l. **** P <0.0001.
Mi̱ görkɛ ɣöö ba riɛk ɛmɛ riali̱kä ɛ jɔc, cua SCLIM bithuali̱dhëcin duŋ Ga̱th1-GFP kɛnɛ Mid2-iRFP rɛy GhLag1 kɛ thec31-1 lëth-thɛnthi̱tib mutant allële (Pi̱guur 4 kɛnɛ Mubi S4). Kɛ kɔr kä mëë caa ER rɔm kä 37°C kä kɛ kɔrɛ cua lony kä 24°C, ri̱w Gath1-GFP ëë pay thänthei̱dhaid cuɛ /thiɛl mi̱ cuɛ mat kä cuɛ däk piny rɛy ER membran kɛɛliw, cie min ca guic ɛ kɔnbenciɔnal mai̱kröthkɔɔpni̱ (Pi̱guur 4, A kɛnɛ B). Ɛ nyɔk bä, perthäntig mi̱ di̱i̱t kä ERES (67%) cuɛ tekɛ ŋɔak da̱ŋ rɛw ti̱ ca mat kɛɛl rɛydɛ (Pi̱guur 4D). Panɛli̱ 1 kɛnɛ 2 kä Thurɛ 4C nyothkɛ cäätni̱ rɛw ti̱ ŋa̱ckɛ kä ERES kɛ Ga̱th1-GFP kɛnɛ Mid2-GFP ti̱ ci̱ rɔ̱ mat. Ɛ nyɔk bä, kɛn kuak da̱ŋ rɛw cua kɛ mat rɛy ERES mi̱ cäät (Pi̱guur 4E, panɛl 3 kɛnɛ muubi S4). Kɛ kui̱c ɛmɔ, min ci̱ ben raar kä kɔn cuɛ nyoth i̱ jɛn bär therami̱de athi̱l cɛɛn rɛy ER membi̱ran ɛ mi̱ gɔa mi̱ nyooth ER prötien aggregɛciɔn kɛnɛ ki̱la̱ththi̱pi̱këcin.
Thek31-1 GhLag1 thëlli̱ nyothkɛ galaktöth-indɔktid thɛkrɛciɔni̱, Ga̱th1-GFP (GPI-AP, mi̱ tɔ̱c) kɛnɛ Mid2-iRFP (TMP, mi̱ yie̱l) kɛnɛ kɔni̱thti̱ti̱ötip ERES-lɛbeli̱d Thek13-mCɛri̱ (ERES, magɛnta) Inkubɛt kä 37°C. Guɔ̱r kɛ minitni 30, yuɔr piny kä 24°C kɛ wuɔ̱cdɛ kɛ thɛkrɛcini̱, kɛnɛ thurɛdɛ kɛɛ SCLIM kɛ kɔr minitni 20. (A ɛ wä kä C) Cuŋkɛ ɛ la 2D pöröjɛkcin thurɛni̱(A;i̱thkiɛl bar,1μm) kiɛ 3D thëll ɣemi̱thpi̱e̱r thurɛni̱(B kɛnɛ C;i̱thkiɛl yunit,0.45μm)kä 10 z-thɛkcini̱ tin ca nyoth ɛ kargö kɛnɛ ERES. Kä panɛl in te piny rɛy (B) kɛnɛ panɛl rɛy (C) nyothkɛ thurɛni̱ tin ca la̱t kɛ nyuɔ̱th ŋɔaani̱ kärɔ̱ tin te rɛy ERES (majɛnta) [Ga̱th1-GFP (mi̱ tɔ̱c) kɛnɛ Mid2-iRFP (mi̱ yie̱l mi̱ buay)]. (C) Arröw mi̱ ca thiäŋ kɛ mi̱ bo̱r: ERES, kuak ti̱ ci̱ rɔ̱ mat. Arröw min ca lɛp: ERES tekɛ duɔ̱ɔ̱r kɛl kärɔa. Panɛl in te piny: Kä ERES min ca kuany tekɛ kuak ti̱ ci̱ rɔ̱ mat (1 kɛnɛ 2) ti̱ ca gɔ̱r rɛy (C). I̱thkiɛl bar, 100 nm. (D) Kuanti̱pi̱këcin duŋ pötömai̱krögra̱p min ca lat rɛy (C). Rɛy sec31-1 kɛnɛ sec31-1 GhLag1 yunitni̱, ɛ kargö kɛl kärɔa (Ga̱th1-GFP kiɛ Mid2-iRFP) ɛ mi̱ ca mat thi̱n, kɛnɛ aberig perthäntig duŋ ERES kɛ kui̱ kargö mi̱ ca la̱th go̱lä kɛnɛ kargö mi̱ ci̱ rɔal. Rɛy ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ diɔ̱k ti̱ cuŋ kärɔ̱, n = 432 rɛy thëlli̱ 54 (thek31-1) kɛnɛ n = 430 rɛy thëlli̱ 47 (thek31-1 GhLag1). Ɛrrɔr bar = SD. T thëm t mi̱ /thiɛl rɛw mi̱ tekɛ juɔ̱l. *** P=0.0002(thek31-1) kɛnɛ ** P=0.0031(thek31-1 GhLag1). (E) 3D thurɛ duŋ ERES min ca kuany kɛ kargö mi̱ ca la̱th wi̱i̱dɛ (3) mi̱ ca nyoth rɛy (C). Ga̱th1-GFP (mi̱ tɔ̱c) kɛnɛ Mid2-iRFP (mi̱ yie̱l) cukɛ thi̱ëëk kɛ ERES (majɛnta) ɛ bä kui̱c kɛl kɛnɛ ɣöö cukɛ cieŋ rɛy gua̱th in ca gaŋ ɛ ERES mi̱ cäät. I̱thkiɛl bar, 100 nm.
Ŋi̱i̱c ɛmɛ cuɛ ŋuni̱ mi̱ jɔc rɛy bi̱bö mi̱ nyoothɛ i̱ lipid-bɛth prötien kargöni̱ kɛn cua kɛ da̱a̱k rɛy thɛlɛktib ɣɛkpörth thaytni̱ rɛy thɛkrɛtöri̱ pa̱thi̱, kɛnɛ ɣöö cuɛ nyoth ɛn min gɔa kä athi̱l cɛɛn lɛŋthi̱ kɛ kui̱ thɛlɛktib thɛlɛkti̱bi̱ti̱. Mi̱ la̱tkɛ jɛ kɛɛ buɔ̱m kɛnɛ ŋok-ɛdge mai̱kröthkɔɔpi̱ tɛkni̱ki̱u mi̱ cɔali̱ SCLIM, kɔnɛ cua nyoth ɛn Gath1-GFP min pay thänthei̱dhaid (ɛ pla̱thma̱ membi̱ran GPI-AP mi̱ di̱i̱t kɛ athi̱l cɛɛn mi̱ bäär ɛlɔ̱ŋ (C26) thɛrami̱d lipid tha̱a̱ŋdɛ) rɛy yi̱th) Kä ri̱jini̱ tin ca mat rɛy thɛkrɛt tra̱ni̱thmembram ERES kɛn cua kɛ mat kɛɛl kɛ rɛydɛ, kä ER membi̱ran (Pi̱guur 1). Ɛ nyɔk bɔ̱, kɛn kuak da̱ŋ rɛw ti̱ti̱ laa kɛ laa wɔ̱ rɛy ERES ti̱ gööl ɛ la ti̱ caa lɛy (Pi̱guur 2). Kä athi̱l cɛɛn lɛŋthi̱ duŋ thëllular thɛrami̱de rɛy membi̱ran cuɛ kuɛ̈ɛ̈ ɛ jiɛn kä C26 ɛ wä kä C18-C16, kä Ga̱th1-GFP ki̱la̱thtɛr cuɛ ya̱r rɛy ER ri̱jin min ca da̱a̱k, kɛnɛ ɣöö Ga̱th1-GFP cuɛ rɔ ri̱t kɛ ba̱nydɛ piny kä ER kɛ tra̱ni̱thmembi̱ran prötien kɛ rɛy ERES mi̱ cäät (Pi̱guur 3 kɛnɛ Thurɛ 3). 4).
Cieŋni̱ min GPI-AP lätdɛ kɛɛ prötien mekani̱dhi̱öm mi̱ rɛlrɔ kɛ ben raar kä ER, cua jiek ɛn ɣöö C26 theramade-diɛn tekä dääkdɛ /cɛ tekä dääk prötien interɛkcini̱ min dɔ̱ŋ bɛ cu nööŋni̱ ERES i̱thpethi̱alaidhɛciɔn (Pi̱guri̱ S4 kɛnɛ S5). Ni̱ ɣöö, min ca jiek kä kɔn cuɛ luäk kɛ dääk mekani̱dhi̱öm mi̱ dɔ̱ŋ min naŋkɛ ɛ lipid-bɛth prötien ki̱la̱thtɛriŋ kɛnɛ ɣöö cua kargöni̱ kɔ̱kiɛn woc kɛ kɔrɛ. Guäcdan cuɛ nyoth i̱ jɛn Gath1-GFP ri̱jin kiɛ buɔ̱n mi̱ thi̱ääk kɛ ERES mi̱ ca lɛy thiɛlɛ tra̱ni̱thmembi̱ran mi̱ ca woc prötien Mid2-iRFP, min nyothɛ jɛ ɛn C26 theramade-dipɛndɛnt GPI-AP buɔ̱n bɛ cu luäk kɛ wädiɛn rɛy ERES in thi̱ääk, kɛnɛ rɛy gua̱th mi̱ cäät, cuɛ tra̱ni̱thmembi̱ran ɛmɛ woc kä Fig. 2). Mi̱ gua̱c, ɛn C18-C16 theramides rɛy ER membɛrɛnä /cɛ GPI-AP jakä bɛ ri̱jini̱ kiɛ ki̱la̱thtɛri̱ nööŋ, kɛ kui̱c ɛmɔ kɛn /ci̱kɛ bi̱ woc kiɛ bi̱ kɛn prötieni̱ tin ca woc woc rɛy ERES mi̱ cäät (Pi̱guri̱ 3 kɛnɛ 4). . Kɛ kui̱c ɛmɔ, kɔn cua lat i̱ C26 theramide bɛ dääk kɛnɛ dääkdiɛn jakä thi̱a̱k kɛ mat prötieni̱ ti̱ ca röm kɛ ERES mi̱ ca lɛy.
Ɛŋu mi̱ dë jiek ɛn C26 ceramide-dipɛndɛnt ki̱la̱thtɛriŋ rɛy ER area mi̱ ca lɛy? Ɛn ɣöö bi̱ membɛrɛn thɛramid rɔ da̱a̱k ɛ latɛrali̱ dɔ̱ŋ bɛ GPI-AP kɛnɛ C26 thɛramid jakä bi̱ kɛ ben ɛ la ti̱ tɔatni̱ kä bi̱ kɛ lipidni̱ ti̱ caa riali̱kä kɛ gua̱a̱th mi̱ tɔt rɛy gua̱th in tä lipidni̱ thi̱n kä ER mɛmbɛrɛn in tä kɛɛ gilaythɛrɔlipidni̱ ti̱ ciɛwciɛw kä /ci̱ thi̱a̱a̱ŋ. Kuali̱ti̱ ki̱la̱thtɛri̱ (17, 18). Kɛn buɔ̱n ti̱ tɔatni̱ ti̱ti̱ bi̱ kɛ rɔ̱ nyɔk kɛ mat ɛ la buɔ̱n mi̱ di̱i̱t, mi̱ ci̱ rɔ gɛr kɛ kɔr kä mi̱ caa kɛ mat kä p24 kɔmpi̱lɛk (34). Ɛ wä kɛɛl kɛ nɛmɛ, cua nyoth i̱ C26 Gath1-GFP go̱o̱rɛ ɣöö bɛ röm kɛ p24 kɔmpi̱lɛk kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ buɔ̱n mi̱ di̱i̱t mi̱ jɔc (Pi̱guur 3). Kä p24 kɔmpi̱lɛk ɛ ɣe̱ti̱rödhai̱göth öligömer min tekɛ p24 tra̱ni̱thmembi̱ran prötieni̱ ŋuaan ti̱ gööl rɛy yi̱th (35), min ŋunɛ ma̱lti̱balɛn baindiŋ, min bi̱ nööŋni̱ ɣöö bi̱ GPI-AP ki̱la̱thtɛri̱ ti̱ tɔatni̱ rɔ̱ mat kɛɛl, kɛ kui̱c ɛmɔ bɛ cu nööŋni̱ I̱thtɛbuɔl ki̱la̱thtɛr mi̱ di̱i̱t (34). Kä röm kam prötien ɣɛktödömiɛni̱ duŋ GPI-APni̱ dɔ̱ŋ bɛ tekɛ luäk kɛ matdiɛn kɛɛl, cie min ca nyoth rɛy Gölgi̱ tra̱ni̱thpɔrdiɛn rɛy mammalian pölaraidhed epi̱thelial thëlli̱ (36). Cieŋni̱ min, mi̱ ci̱ C18-C16 therami̱de te thi̱n rɛy ER membi̱ran, mi̱ ci̱ p24 kɔmpi̱lɛk rɔ mat kä Ga̱th1-GFP, bi̱ buɔ̱n mi̱ di̱i̱t mi̱ göl rɔ bi̱ nööŋ. Kä mekani̱dhi̱öm in te pinydɛ dɔ̱ŋ bɛ tekä ciɛŋ pi̱dhikal kɛnɛ kemi̱kali̱ tin ca lɛy kä lɔɔŋ athi̱l cɛɛn thɛrami̱de. Ŋi̱i̱cni̱ baöpi̱i̱dhi̱kal nyin arti̱pi̱cial membi̱rani̱ nyothɛ jɛ i̱ cieŋni̱ min kɛn da̱ŋ rɛw bär (C24) kɛnɛ ciɛk (C18-C16) athi̱l cɛɛn theramaidni̱ dɔ̱ŋ bɛ cu nööŋni̱ dääk pi̱e̱e̱thni̱, ɛ athi̱l cɛɛn theramaidni̱ mi̱ bäär kärɔa (C24) min bi̱ Kurbɛciɛr mi̱ di̱i̱t nööŋ kɛnɛ pilim mi̱ ci̱ rɔ ri̱t kɛ riali̱ pilimä i̱kä. Kɛ rɛy ruacdiɛn kɛɛl(17,37,38). Jɛn cua nyoth i̱ jɛn tra̱ni̱thmembi̱ran ɣeli̱dh duŋ TMED2, kä yuman ɣömölög duŋ Emp24, thɛlɛkti̱bi̱li̱ interɛkcini̱ kɛ C18 therami̱de-bɛth i̱thpiŋömai̱lin rɛy thai̱töpla̱thmik löbu̱li̱ (39). Mi̱ la̱tkɛ möli̱ki̱öl dai̱na̱mikni̱ (MD) thi̱mulɛciɔni̱, cua jiek ɛn ɣöö kɛn C18 kɛnɛ C26 thɛramidni̱ cukɛ rɔ̱ dol rɛy thai̱töpla̱thmik löbu̱li̱ nyin Emp24 tra̱ni̱thmembi̱ran ɣeli̱dh, kɛnɛ ɣöö kɛn tekɛ ti̱ cäät ti̱ nhɔk kɛn kɛ (Pi̱guur S6). Jɛn gɔaaɛ ɛn ɣöö ba ŋa̱c ɛn ɣöö nɛmɛ nyothɛ jɛ ɛn tra̱ni̱thmembi̱ran ɣeli̱dh duŋ Emp24 bɛ cu nööŋni̱ ɣöö bi̱ lipidni̱ rɔ̱ da̱a̱k rɛy membɛrɛnä. Nɛmɛ ɛ mi̱ pay ben raar mi̱ lät kä thëlli̱ mammalian. MD thi̱mulɛciɔni̱ ti̱ cäät bä nyothɛ ta̱a̱ ether lipidni̱ thi̱n (40). Kɛ kui̱c ɛmɔ, kɔn cua lat i̱ C26 theramide rɛy löbuɔli̱ rɛw nyin ER26 ɛ mi̱ ca ri̱i̱ŋ gua̱a̱thdɛ. Mi̱ ci̱ GPI-AP rɛy luminal löbuli̱ rɔ mat kɛ mälti̱balɛn p24 kɛnɛ ruuli̱ C26 thɛramid gekä p24 rɛy thai̱töpla̱thmik löbuli̱, jɛn bɛ Prötien aggregɛcin kɛnɛ membi̱ran kurbɛciɔn nööŋ kɛ rɛy yiɛtni̱ (41), min bi̱ GPI-AP jakä ɣöö bɛ rɔ da̱a̱k ɛ la di̱thki̱ri̱. ri̱jini̱ nyin ER membi̱ran (42). Ri̱pɔ̱tni̱ tëë nhiam cukɛ mekani̱dhi̱öm ëë ca nööŋ nhial luäk (43, 44). Kä ma̱ltibalɛn baindiŋ duŋ öligölɛktini̱, pa̱thöji̱ni̱ kiɛ ani̱buɔdi̱ni̱ ɛ wä kä thɛrami̱d-bɛth glaiköthpiŋölipi̱dni̱ (GSL) kä pla̱thma̱ membɛrɛn la no̱o̱ŋɛ GSL aggregɛciɔn mi̱ di̱i̱t, bɛ pe̱kdɛ jakä di̱t kä bɛ cu nööŋni̱ ɣöö bi̱ membɛrɛn rɔ gɛr kɛnɛ intɛrnalaidhɛciɔn (44). Iwabuci ɛkw. (43) Jɛn cua jiek ɛn ɣöö rɛydɛ tekɛ mi̱ bäär (C24) duŋni̱ ɣöö /cɛ ciɛk (C16) athi̱l cɛɛn, kä ma̱lti̱balɛn li̱gand min ca yian kä GSL laktöthailtheramide cuɛ nööŋni̱ ɣöö bɛ cu tekɛ buɔ̱n mi̱ di̱i̱t kɛnɛ kɔmbɛrɛn inba̱ji̱nɛciɔn, kɛnɛ ɣöö ɛn thai̱töpla̱thmi̱ Lyn-mediated thi̱knal tra̱ni̱thda̱kciɔn rɛy cagi̱ti̱rup ɛ interda̱kciɔn kä lea̱pi̱di̱lleth ɛ interda̱kciɔn.
Rɛy mammalian pölaraidhed epi̱thelial thëlli̱, ɛn kɔncentrɛciɔn duŋ anti̱-Gölgi̱ netwɔk (TGN) ɛ wä kä lɛbel duŋ apikal pla̱thma̱ membi̱ran kɔnti̱röl dääkdɛ kɛnɛ thɔ̱rtiŋ duŋ GPI-AP (10, 45). Aggregɛcin ɛmɛ ɛ mi̱ nööŋkɛ ɛ GPI-AP öligömeraidhɛciɔn (36), duŋni̱ ɣöö jɛn bä bɛ tekä thɛrami̱d cɛɛn lɛŋthi̱ min ca jiek rɛy yi̱th. Cieŋni̱ min mammalian GPI-AP tëkɛ ether lipid-bɛth ankɔr, kɛnɛ kemi̱kal i̱thtra̱kciɛrdɛ tekɛ dääk mi̱ di̱i̱t ɛlɔ̱ŋ kɛ athi̱l cɛɛn thɛramid mi̱ bäär ɛlɔ̱ŋ, rɛy ŋi̱i̱cä mi̱ thi̱a̱k cuɛ jiek ɛn ɣöö lipidni̱ da̱ŋ rɛw tekɛ eboluciɔnalli̱ ti̱ cäät pua̱nykiɛn kɛnɛ kemi̱kal ciɛŋni̱kiɛn kɛnɛ la̱tdiɛn (40). Kɛ kui̱c ɛmɔ, ɛn ether lipid tha̱a̱ŋdɛ rɛy thëlli̱ mammalian dɔ̱ŋ bɛ ca̱a̱t kɛ C26 thɛrami̱d rɛy yi̱th, kɛnɛ ɣöö la̱tdɛ ɛ ɣöö bɛ rɔ mat kɛ lɔɔŋ-cɛɛn thɛrami̱d rɛy membi̱ran kɛ rëp GPI-AP aggregɛciɔn kɛnɛ thɔ̱rtiŋ. Cieŋni̱ min nɛmɛ derɛ rɔ lot ŋotdɛ go̱o̱rɛ ɣöö ba ɣɔ̱n ɛ jɔc, tëë ca jiek kɛ nhiam luäkɛ jɛ ɛn ɣöö ja̱l athi̱l cɛɛn therami̱de mi̱ bäär ɛ wä kä puɔ̱ny Gölgi̱ ɛ mi̱ /ca naŋ ɛ thai̱töpla̱thmik tra̱ni̱thper prötieni̱, duŋni̱ ɣöö jɛn tëkä thänthethi̱th duŋ GPI ankɔri̱ ce̱tkɛ yi̱th. Kɛ kui̱c ɛmɔ, ɛn eboluciɔneri̱ kɔntherbɛtib mekani̱dhi̱öm cuɛ ce̱tkɛ mi̱ luäŋɛ rɔ kɛ thɛlɛkti̱bi̱li̱ kɔ-tra̱ni̱thpɔr mi̱ bäär ɛlɔ̱ŋ kä athi̱l cɛɛn thɛramaid kɛnɛ GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) rɛy tra̱ni̱thpɔr bɛthi̱kal mi̱ cäät.
Rɛy yi̱th kɛnɛ mammalian pölaraidhed epi̱thelial thëll thi̱thtɛm, GPI-AP aggregɛcin kɛnɛ dääkdiɛn kɛ pla̱thma̱ membi̱ran prötieni̱ kɔ̱kiɛn kɛndiaal la tuɔɔkɛ ɛ ŋot /kenɛ ni̱ cop kä thëll thɔ̱rpëth. Paladinö kɛnɛ al. (48) cuɛ jiek ɛn ɣöö kä TGN duŋ mammalian polaraidhed epi̱thelial thëlli̱, GPI-AP ki̱la̱thtɛriŋ ɛ mi̱ /ciɛɛ mi̱ lot rɔ kärɔa kɛ kui̱ thɛlɛktib ki̱la̱ththi̱pi̱këcin duŋ GPI-APni̱ ɛ wä kä apikal pla̱thma̱ membi̱ran, duŋni̱ ɣöö bä cuɛ ki̱la̱thtɛriŋ ɣɔrgani̱dhi̱öcin duŋ GPI-APni̱ kɛnɛ lätkɛ baölöji̱kal riali̱kä. Thëll thɔ̱rpëth. Rɛy yi̱th, ŋi̱i̱c ɛmɛ cuɛ nyoth i̱ jɛn C26 theramade-dipɛndɛnt GPI-AP ki̱la̱thtɛr kä ER bɛ ki̱la̱thtɛr ɣɔrgani̱dhi̱öni̱ riali̱kä kɛnɛ pa̱ŋcinal ɛkti̱bi̱ti̱ duŋ GPI-AP kä pla̱thma̱ membi̱ran (24, 49). Mi̱ wä kɛɛl kɛ mödɛl ɛmɛ, GhLag1 thëlli̱ kɛn kɛ allerji̱kal kä GPI ini̱bi̱tɔri̱ kiɛ wal tin ya̱ri̱ thëll wuɔɔl integri̱ti̱ (28), kɛnɛ min go̱o̱r pa̱ŋcinal Gath1-GFP ki̱la̱thtɛri̱ (49) duŋ tip therami̱de min ca pöröjɛkted rɛy matdä yi̱th thëlli̱ nyothɛ G Pöthi̱löji̱kal pi̱thi̱ölöji̱kal kɔkuɛnthi̱ɛnthni̱ duŋ hLag1. GPI-AP ɛ mi̱ ci̱ duer. Cieŋni̱ min, thëm mi̱ dɔ̱ŋ mi̱ bi̱ pa̱ŋcinal ɣɔrgani̱dhi̱öcin duŋ thëll thɔ̱rpëth cua prögi̱ra̱m kä ER ɛ ca̱p mi̱ ca da̱a̱k mi̱ lät kä lipid lɛŋthi̱ bɛ cua thɔbjek duŋ ri̱thääcä dan in bi̱ ben.
Kä Thakkarömai̱thi̱th cerebi̱thiae i̱thtrainni̱ tin lät rɛy la̱t ɛmɛ cua kɛ gɔ̱r piny rɛy Tɛbɛlä S1. Kä MMY1583 kɛnɛ MMY1635 i̱thtrainni̱ duŋ SCLIM kɛ kui̱ thëll mi̱ tëk i̱mëjiŋ cua kɛ la̱t rɛy bɛkgi̱rɔɔn duŋ W303. I̱thtrainni̱ ti̱ti̱ cua kɛ nyoth ɛ la Sec13-mCerry kɛ pluorethɛn prötien tag cua kɛ la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ pöli̱merath cɛɛn riakciɔn (PCR)-bɛth methɔd kɛ pFA6a pla̱thmid cie mi̱ ɛ tɛmpi̱lɛt (23). Kä i̱thtrain min nyoth Mid2-iRFP cua lɛbeli̱d kɛ pluorethɛn prötien piny kɔnti̱röl duŋ GAL1 prömötɛr cua la̱t cie mi̱ guɔ̱r kɛrɔ̱. PCR ampli̱pi̱këcin duŋ iRFP-KanMx thi̱kuɛnthi̱ mi̱ bä kä pKTiRFP-KAN bɛktɔr (muc duŋ E. Ö'Cia, Addjen pla̱thmid nämbär 64687; http://n2t.net/addjen: 64687; ri̱thääc rethɔɔr ai̱dentpi̱e̱e̱r (RRID): Addjen_646uthterted duŋ C. Kɛ kɔr kä mëë caa Mid2-iRFP jenɔm thi̱kuɛnthi̱ jakä di̱t kɛnɛ ɣöö cua klɔn rɛy GAL1 prömötɛr, jɛn cua mat rɛy Not I-Sac I thayt duŋ matdä pla̱thmid pRS306. Kä pla̱thmid pRGS7 ëë ci̱ ben raar cua li̱ni̱e̱e̱raidhed kɛ Pst I kɛ matdɛ rɛy URA3 löka̱th.
Kä Ga̱th1-GFP puciɔn ji̱i̱n ɛ mi̱ ca nyoth piny kɔnti̱röl duŋ GAL1 prömötɛr rɛy thɛntrömere (CEN) pla̱thmid, min cua la̱t cie mi̱ guɔ̱r kɛrɔ̱. Kä Ga̱th1-GFP thi̱kuɛnthi̱ cua jakä di̱t ɛ PCR ɛ jiɛn kä pRS416-GAS1-GFP pla̱thmid (24) (muc duŋ L. Pöpölö) kɛnɛ ɣöö cua klɔn rɛy Xma I-Xho I gua̱a̱th duŋ CEN pla̱thmid pBEVY-GL LEU2 (muc duŋ C). Miller; Adjɛn pla̱thmid nämbär 51225; Ɣɔ̱tp/n2t.nɛt/addjɛn: 51225; RRID: Adjɛn_51225). Kä pla̱thmid ëë ci̱ ben raar cua ci̱ötdɛ pRGS6. Kä Axl2-GFP puciɔn ji̱i̱n jɛn bä cua nyoth piny kɔnti̱röl duŋ GAL1 prömötɛr duŋ pBEVY-GL LEU2 bɛktɔr, kɛnɛ ɣöö ta̱thdɛ cuɛ cie mi̱ guɔ̱r kɛrɔ̱. Kä Adhl2-GFP thi̱kuɛnthi̱ cua jakä di̱t kä pRS304-p2HSE-Adhl2-GFP pla̱thmid (23) ɛ PCR, kɛnɛ ɣöö cua klɔn rɛy Bam HI-Pst I thayt duŋ pBEVY-GL LEU2 bɛktɔr. Kä pla̱thmid ëë ci̱ ben raar cua ci̱ötdɛ pRGS12. Kä thi̱kuɛnthi̱ duŋ öligöni̱ki̱li̱ötaidni̱ min ca la̱t rɛy ŋi̱i̱cä nɛmɛ cua kɛ gɔ̱r piny rɛy Tɛbɛlä S2.
Kä i̱thtrain cua mat kɛɛ 0.2% adenain kɛnɛ 2% glukööth [YP-dɛkthtröth (YPD)], 2% rappinöth [YP-rappinöth] ri̱c yi̱th ɣɛktra̱k prötien p (YP) mëdiöm (1 % Yi̱th ɣɛktra̱k kɛnɛ 2% prötien ept). (YPR)] kiɛ 2% galaktöth [YP-galaktöth (YPG)] cie min tuɔɔk karbön thi̱n, kiɛ rɛy thi̱nthethtik mini̱ma̱l mëdiöm (0.15% yi̱th nai̱tröji̱n bɛth kɛnɛ 0.5% ammöniöm tha̱lpët) kɛ rëpdɛ kɛɛ aminö athi̱dni̱ ti̱ ro̱ŋ kɛnɛ bɛthni̱ tin görkɛ kɛ kui̱ mi̱eth, Kä tekɛ 2% mini̱ma̱l glukööth2) (thänthethtik galaktöth mi̱ tɔt mi̱diöm) cie gua̱a̱th in tuɔɔk karbön thi̱n.
Kɛ kui̱ ri̱i̱l-tai̱m i̱mëjiŋ, lëth-thɛnthi̱tib thek31-1 mutant thëlli̱ cuɛ nyothni̱ kɔntra̱k piny GAL1 prömötɛr cua kɛ pith rɛy YPR mëdiöm kä 24°C kɛ wäär ɛ wä kä mid-lög pɛth. Kɛ kɔr kä mëë ca la̱th rɛy YPG kä 24°C kɛ thaak 1, kɛn thëlli̱ cua kɛ inkubɛted rɛy SG kä 37°C kɛ minitni̱ ti̱ 30, kɛ kɔrɛ cua kɛ naŋ kä 24°C kɛ wuɔ̱cdiɛn kä thɛkrɛciɔn bɔlɔk. Kɔnkanabalin A cua la̱t kɛ riali̱ thëlli̱ i̱kä kä gi̱laath i̱thlai̱d kɛnɛ ɣöö cua thurɛdɛ la̱t ɛ SCLIM. SCLIM ɛ mat duŋ Olympus IX-71 inbɛrtid pluorethcen mai̱kröthkɔɔp kɛnɛ UPlanSApo' 100×1.4 nämerikal aperture ɣöyɔl lɛni̱ (Olympus), ɣai̱-i̱thpi̱i̱d kɛnɛ ɣai̱-thi̱knal-ɛ wä kä-nɔi̱th rɛci̱ö mi̱ wil di̱thki̱ kɔnpökal i̱thkannɛr (Yökögawa Elɛkti̱rik kɛnɛ ka̱thtɔm i̱thpekti̱römi̱ti̱r i̱thkannɛr, (Ɣamamatthu Pötönikni̱) bɛ cu nööŋni̱ magni̱pi̱piŋ lɛni̱ thi̱thtɛm kɛ magni̱pi̱këcin in jɔak duŋ ×266.7 kɛnɛ ca̱rji̱-kɔppled di̱bai̱ kamɛra min jak elɛkti̱rɔni̱ kä ŋuan (Ɣamamatthu Pötönikni̱) (21). Thurɛ min ca jiek ɛ mi̱ la̱tkɛ ɛ thɔpwɛɛr mi̱ caa riali̱kä (Yokogawa Electric). Kɛ kui̱ thurɛni̱ 3D, kɔn cua la̱t kɛ kathtɔm-made piedhöelektrik aktuɛtɔr kɛ gër objɛktib lɛni̱ ɛ cuŋɛ ɛ wä nhial, kɛnɛ ɣöö cua tha̱a̱ŋ optikal ruuli̱ 100 nm ɛ tekɛ dääk rɛy i̱thtɛkä. Kä Z-i̱thtɛk thurɛ cua riali̱kä ɛ la 3D bɔkthel data, kɛnɛ ɣöö ɛn thi̱o̱o̱ri̱kal puɔɔny spread pa̱ŋciɔn min lät kɛ kui̱ di̱thki̱ kɔnpökal mai̱kröthkɔɔp mi̱ wil rɔ ɛ mi̱ lät kɛ dekɔnbölucin pröthethiŋ ɛ Bölöci̱ti̱ thɔpwɛɛr (PerkinElmer). Kɛ la̱tdɛ kɛɛ Bölöciti̱ thɔpwɛɛr kɛ thëmdɛ kärɔa kɛ kui̱ kɔ-lökɛciɔn anali̱thi̱th, ERES cu määni̱ kargö cua thɛm. Lany i̱thkan anali̱thi̱th cua la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ MetaMörp thɔpwɛɛr (Mölekular Di̱bai̱thni̱).
La̱tdɛ GraphPad Pri̱dhi̱m thɔpwɛɛr kɛ jiek i̱thtathti̱thtikal thi̱gni̱pi̱kanci̱. Kɛ kui̱ t-thɛm duŋ Gaat duëlgɔ̱rä min tekɛ tuɔ̱ŋ da̱ŋ rɛw kɛnɛ min ŋa̱ckɛ kä duɔ̱ɔ̱p kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱ (ANOVA) thëm, dääk kam buni̱ cua kɛ guic i̱ tekɛ mi̱ di̱i̱t mi̱ cɛ gɛr kä P <0.05 (*).
Kɛ kui̱ pluorethcen mai̱kröthkɔɔpi̱ duŋ Ga̱th1-GFP, kä lög pɛth thëlli̱ cua kɛ pith kɛ wäär rɛy YPD kɛnɛ ɣöö cua kɛ ruuli̱ ɛ thɛnti̱ri̱pugɛcin, cua kɛ lak ni̱ kä rɛɛw kɛ pöthpët buppered thalain, kɛnɛ ɣöö cua kɛ inkubɛted kä ɣaci̱ kɛ minitni̱ ti̱ 15, kɛ kɔrɛ cua kɛ wä piny mai̱kröthkɔɔpi̱ cie min ca lat ni̱ wän (Check2). Kä Leica DMi8 mai̱kröthkɔɔp (HCX PL APO 1003/1.40 ɣöyɔl PH3 CS) cua riali̱kä kɛ objɛktib lɛni̱, L5 (GFP) pi̱li̱tɛr, Ɣamamatthu kamɛra kɛnɛ Appli̱këcin Thuite X (LAS X) thɔpwɛɛr cua la̱t kɛ kui̱ kä ɣöö ba jiek. .
Kä tha̱mpuɔli̱ cua kɛ denatured kɛ SDS tha̱mpuɔl bupper kä 65°C kɛ minitni̱ 10, kɛ kɔrɛ cua kɛ da̱a̱k ɛ SDS-pöliakrilamide jel elektröpörethi̱th (PAGE). Kɛ kui̱ immi̱o̱nöblötiŋ anali̱thi̱th, 10 μl duŋ tha̱mpuɔlä cua la̱th kä lɛne kɛl. Pri̱mari̱ ani̱buɔdi̱: La̱tdɛ kɛɛ pɛlpɛl pöli̱klönal anti̱-Ga̱th1 kä di̱luciɔn duŋ 1:3000, pɛlpɛl pöli̱klönal anti̱-Emp24 kä di̱luciɔn duŋ 1:500, kɛnɛ pɛlpɛl pöli̱klönal anti̱-GFP (ɛ muc mi̱ bä kä H. Riedhman) kä di̱luciɔn duŋ 1:3000. Kä muɔth mönöklönal anti̱-Pgk1 anti̱bo̱di̱ cua la̱t kä di̱luciɔn duŋ 1:5000 (ɛ muc mi̱ bä kä J. de la Krudh). Thɛkɔnderi̱ ani̱buɔdi̱: Ɣɔrthɛradith perɔkthai̱dɛth (HRP) kɔnjugɛted goat anti̱-rabbit immi̱o̱glöbulin G (IgG) la̱tdɛ kɛɛ di̱luciɔn duŋ 1:3000 (Pierce). HRP-kɔnjugɛted dɛyjiɛn anti̱-muɔth IgG cua la̱t kä di̱luciɔn duŋ 1:3000 (Pierce). Kä immi̱o̱n ri̱thpɔn dhuun cua guic ɛ kemi̱luminethcen methɔd duŋ ThuperThi̱gnal Wɛth Pikö reajɛnt (Thermö Pi̱ther Thaanytipik).
Cie min ca lat rɛy (31), ɛ näci̱ral immi̱o̱nöprecipi̱tɛciɔn ɣɛkpi̱ri̱mɛn cua la̱t kä enri̱cid ER pi̱rɛkcin. Rɛydɛ mi̱ ciɛk, lak yi̱th thëlli̱ kɛ TNE bupper [50 mM tri̱th-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM peni̱lmethi̱lthɔ̱lpöni̱l pluoraid kɛnɛ prötieath ini̱bi̱tɔr mi̱ ca li̱ɔɔm) kä 600 nm (OD600 kä rɛɛw) kä 100 opti̱kal. Jɛn cua tiath kɛ gi̱laath bi̱i̱dni̱, kä kɛ kɔrɛ cua thëll debri̱th kɛnɛ gi̱laath bi̱i̱dni̱ woc ɛ thɛnti̱ri̱pugɛciɔn. Kä thuperna̱tɛn cua kɛ kɔrɛ thɛnti̱ri̱puɔɔd kä 17,000 g kɛ minitni̱ 15 kä 4°C. Kä pellet cua nyɔk kɛ thɔ̱thpɛndiŋ rɛy TNE kɛnɛ ɣöö cua di̱ji̱tali̱th thapönin mat thi̱n ɛ la min jɔak kä 1%. Kä tha̱thpɛnciɔn cua inkubɛted kɛ thaak 1 kɛ ri̱etdɛ kä 4°C, kɛ kɔrɛ cua kɔmpönɛni̱ tin /ci̱ li̱ööm woc ɛ thɛnti̱ri̱pugɛciɔn kä 13,000 g kä 4°C kɛ minitni̱ ti̱ 60. Kɛ kui̱ Ga̱th1-GFP immi̱o̱nöprecipi̱tɛciɔn, kɛ nhiam pre-inkubɛt tha̱mpuɔl kɛ agaröth beadni̱ ti̱ baŋ (KrömöTek) kä 4°C kɛ thaak 1, kɛ kɔrɛ inkubɛt kɛ GFP-Trap_A (KrömöTek) kä 4°C kɛ thaakni̱ 3. Kä immi̱o̱nöprecipi̱ted beadni̱ cua kɛ lak ni̱ kä dhie̱e̱c kɛ TNE min te 0.2% di̱gödhi̱jenin, cua kɛ woc kɛ SDS tha̱mpuɔl bupper, cua kɛ da̱a̱k kä SDS-PAGE, kɛnɛ ɣöö cua kɛ die̱l guäc ɛ immi̱o̱nöblötiŋ.
Cie min ca lat rɛy (31), ri̱w-linkiŋ determinɛciɔn cua la̱t kä enri̱cid ER pi̱rɛkcin. Kɛ ciɛk, ɛn ER pi̱rɛkcin ëë ci̱ rɔ rep cua inkubɛted kɛ 0.5 mM dithi̱öbi̱th(thukcini̱midal pröpiönat) (Pierce, Thermö Pi̱ther Thaanytipik, Rɔkpuɔɔt, IL, USA; 20°C, 20 min). Kä riakciɔn min ca röm cua woc ɛ matdɛ kɛɛ glai̱thin (50 mM min jɔak kä kɔncentrɛciɔn, minitni̱ 5, 20°C).
Cie min ca lat ni̱ wän (50), MS anali̱thi̱th duŋ theramide rɛy wild-taap kɛnɛ GhLag1 i̱thtrainni̱ cua la̱t. Rɛy gua̱th mi̱ ciɛk, thëlli̱ cua kɛ pith ɛ wä kä ɣɛkpönɛncial pɛth (3 ɛ wä kä 4 OD600 yunitni̱/ml) rɛy YPD kä 30°C, kɛnɛ 25×107 thëlli̱ cua kɛ ŋɛɛr. Metɛböli̱dhi̱ömdiɛn la jakɛ kä thuɔ̱k kɛ trai̱klöröathetik athi̱d. La̱tdɛ ɣɛktra̱kciɔn thɔlbɛn [ethanöl, pi̱w, ether, pai̱ri̱din kɛnɛ 4.2 N ammöniöm ɣai̱drökthai̱d (15:15:5:1:0.018 v/v)] kɛnɛ 1.2 nmol duŋ intɛrnal i̱thtandar C17 thɛrami̱d (860517, Abanti̱ pölar lipid) kuali̱ti̱). La̱tdɛ kɛɛ mönömethylamine reagent [methanöl, pi̱w, n-butanɔl kɛnɛ methylamine thɔ̱luciɔn (4:3:1:5 v/v)] kɛ la̱t alkaline ɣai̱dröli̱thi̱th mi̱ tɔt duŋ ɣɛktra̱k, kɛ kɔrɛ lätdɛ kɛɛ pi̱w-tha̱turated n-butanɔl kɛ dethalt. Kɛ jɔakdɛ, ɛn ɣɛktra̱k cua nyɔk kɛ thɔ̱thpɛndiŋ rɛy puɔ̱thi̱tip mödɛl thɔlbɛn [klöröpuɔm/methanöl/pi̱w (2:7:1) + 5 mM ammöniöm acëtat] kɛnɛ ɣöö cua tuɔm rɛy ma̱th i̱thpekti̱römi̱ti̱r. Ma̱lti̱-riakciɔn möni̱tɔriŋ (MRM) cua la̱t kɛ ŋi̱e̱c kɛnɛ kua̱nti̱pi̱këcin duŋ i̱thpiŋölipi̱d möli̱ki̱öli̱. Kä TSQ Bantage terciari̱ kuadrupöl ma̱th i̱thpekti̱römi̱ti̱r (Thermö Pi̱ther Thaanytipik) ɛ mi̱ ca riali̱kä kɛ röbɔtik nanöplöw ayɔn gua̱a̱th in tuɔɔk Nanömat HD (Adbiön Baöthaanyni̱, Ithaka, NY) kɛ kui̱ lipid anali̱thi̱th. Kä kɔlli̱ciɔn enerji̱ ɛ mi̱ ca riali̱kä kɛ kui̱ therami̱de kategöri̱ kärɔa. MS data cua jiek rɛy puɔ̱thi̱tib mödɛl. Kɛ kui̱ baölöji̱kal replikɛt kärɔa, ɛn lipid thi̱knal ɛ mi̱ te kamdiɛn kä thëm diɔ̱k ti̱ cuŋ kärɔ̱.
Cie min ca lat rɛy (31), kɛn thëlli̱ (800×107) tin nyoth Ga̱th1-GFP cua kɛ la̱th kä näci̱ral immi̱o̱nöprecipi̱tɛciɔn. Kä Ga̱th1-GFP mi̱ ca riali̱kä cua da̱a̱k ɛ SDS-PAGE kɛnɛ ɣöö cua naŋ kä pöli̱bai̱nali̱deen pluoraid (PVDF) membɛrɛn. Kä prötien cua guic ɛ biɛl PVDF kɛ amide mi̱ bo̱r. Kä Ga̱th1-GFP ba̱nd cua ŋuɔ̱k kä PVDF kɛnɛ ɣöö cua lak ni̱ kä 5 kɛ methanöl kɛnɛ kä kɛɛl kɛ li̱kuid krömatögra̱pi̱-MS (LC-MS) gi̱rɛd pi̱i̱ni̱. Mi̱ ca membi̱ran i̱thti̱ri̱p inkubɛtiŋ kɛ 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), bupper kɛnɛ 500μl mi̱ pay li̱ööm 1 M thɔ̱diöm nai̱trai̱te mi̱ ca li̱ɔɔm kä 37°C kɛ thaakni̱ 3, ɛn lipid pi̱rɛkcin bɛ cu ben raar kä Ga̱th1-GFP kɛnɛ lai̱thed inököthai̱n Reli̱th duŋ inökömi̱n. (51). Kɛ kɔrɛ, ɛn membi̱ran i̱thti̱ri̱p cua lak ni̱ kä ŋuaan kɛ pi̱w LC-MS gi̱rɛd, cua jakä kööt rɛy lëthä duëël, kɛnɛ ɣöö cua tɔ̱w rɛy nai̱tröji̱n atmɔthi̱pi̱e̱e̱r kä -80°C amääni̱ mëë cua anali̱thi̱th la̱t. Cie kɔnti̱röl, ɛ tha̱mpuɔl mi̱ baŋ duŋ PVDF membran cua la̱t kɛ kui̱ ɣɛkpi̱ri̱mɛnä kɛl. Kä lipid ëë ca woc kä Ga̱th1-GFP cua kɛ kɔrɛ die̱l guäc ɛ MS cie min ca lat (50). Rɛydɛ mi̱ ciɛk, PVDF i̱thti̱ri̱pni̱ tin tekɛ GPI-lipid cua kɛ nyɔk kɛ thɔ̱thpɛndiŋ rɛy 75μl negɛtib möl thɔ̱lbɛn [klöröpuɔm/methanöl (1:2) + 5 mM ammöniöm acëtat] kɛnɛ ɣöö cua elektröthpi̱rɛy aönaidhɛciɔn (ESI)-MRM/MS Anali̱thi̱th duŋ i̱thpiŋölipid i̱thpethi̱thni̱ (TSQ Bantage) wä. Rɛy kä nɛmɛ, MS data cua jiek rɛy negɛtib ayɔn mödɛl.
Cie min ca lat ni̱ wän, ɛn tha̱a̱ŋ lipid duŋ GPI ankɔr cua da̱a̱k kä [3H]-inöthitɔl-lɛbeli̱d GPI-AP (16). Kä lipidni̱ cua kɛ da̱a̱k ɛ thi̱i̱n-lɛyɛr krömatögra̱pi̱ kɛ la̱tdɛ kɛɛ thɔlbɛn thi̱thtɛm (55:45:10 klöröpuɔm-methanöl-0.25% KCl) kɛnɛ ɣöö cua kɛ guic kɛ la̱tdɛ kɛɛ FLA-7000 (Pujipilm).
Kä thëlli̱ tin nyoth Gath1-GFP (600×107) cua kɛ lak ni̱ kä rɛɛw kɛ TNE bupper kɛ TNE bupper, kɛnɛ ɣöö cua kɛ däk kɛ gi̱laath bi̱i̱dni̱, kɛ kɔrɛ cua kɛ thɛnti̱ri̱puɔɔd kɛ wuɔ̱c thëlli̱ tin ci̱ duɔth kɛnɛ gi̱laath bi̱i̱dni̱. Kä thuperna̱tɛn cua kɛ kɔrɛ thɛnti̱ri̱puɔɔd kä 17,000 g kɛ thaak 1 kä 4°C. Kä pellet cua lak rɛy TNE kɛnɛ ɣöö cua inkubɛted kɛ 1 U PI-PLC (Inbi̱tröjen) rɛy TNE min te 0.2% di̱ji̱tali̱th thapönin kɛ thaak 1 kä 37°C. Kɛ kɔr kä mëë ca endhɛm la̱th lät, ɛn membi̱ran cua woc ɛ thɛnti̱ri̱pugɛciɔn kä 17,000 g kä 4°C kɛ thaak 1. Mi̱ görkɛ i̱mmi̱o̱nöprecipi̱tɛt Ga̱th1-GFP, kä thuperna̱tɛn cua inkubɛted kɛ GFP-Trap_A (KrömöTek) kä 4°C kɛ wäär. Kä Ga̱th1-GFP mi̱ ca riali̱kä cua da̱a̱k ɛ SDS-PAGE cua biɛl kɛ Kuomaththie brilliant blue. Kä Gath1-GFP i̱thtɛniŋ ba̱nd cua ŋuɔ̱k kä grey min ci̱ akuedak göl piny, kɛ kɔrɛ kɛ kɔr alki̱lɛciɔn kɛ ai̱ödöacetami̱d kɛnɛ jakdɛ kä kuiy kɛ di̱thi̱öthreitöl, rɛy-jel dai̱jɛciɔn kɛ trai̱pthin cua la̱t. Ɛkthtra̱k kɛnɛ dry triptik peptaidni̱ kɛnɛ peptaidni̱ kɛ GPI-glaikanni̱. Kä peptaid ëë ci̱ kööt cua liɔm rɛy pi̱i̱ni̱ ti̱ 20 μl. Injɛkciɔn tha̱a̱ŋdɛ (8μl) rɛy LC. Ɛn ɣɔktadethi̱lthilan (ODS) kɔlöm (Debelöthi̱l 300ODS-HG-5; rɛydɛ ɛn dai̱mi̱ti̱r 150 mm×1.0 mm; Nomura Kɛmi̱kal, Aici Prepekciɛr, Japan) cua la̱t kɛ dääk peptaidni̱ piny gua̱thni̱ ti̱ ca lɛy kä gi̱rɛdiɛn. Kä mobail pɛth ɛ thɔ̱lbɛn A (0.08% puɔrmik athi̱d) kɛnɛ thɔ̱lbɛn B (0.15% puɔrmik athi̱d rɛy 80% acëtönitrail). Ɛn Accela HPLC thi̱thtɛm (Thermö Pi̱ther Thaanytipik, Böthtɔn, Maththacuthɛtti̱th) cua la̱t kɛ wuɔ̱c kɔlömni̱ kɛ thɔlbɛn A rɛy minitni̱ ti̱ 55 kä ja̱l rɛt duŋ 50 μl min-1 kɛ minitni̱ 5, kɛ kɔrɛ cua kɔncentrɛciɔn duŋ thɔlbɛn B re̱p ɛ wä kä 40%. , Yunai̱tid I̱thtët). Kä eluate cua ŋot kɛ mi̱ no̱o̱ŋɛ rɛy ESI ayɔn gua̱a̱th in tuɔɔkɛ thi̱n, kɛnɛ ɣöö cua trai̱ptik peptaidni̱ kɛnɛ peptaidni̱ kɛ GPI-glaikanni̱ cua kɛ die̱l guäc ɛ LTQ Örbi̱trap XL (ɣai̱bri̱d li̱ni̱e̱e̱r ayɔn trap-örbi̱trap ma̱th i̱thpekti̱römi̱ti̱r; Thermö Pi̱ther Thaanytipik). Rɛy MS thɛtap, ɛn böltɛj duŋ kapi̱lli̱ri̱ gua̱a̱th in tuɔɔkɛ thi̱n cua yiath piny kä 4.5 kV, kɛnɛ ɣöö ɛn lëth duŋ kapi̱lli̱ri̱ min naŋkɛ cua yiath piny kä 300°C. Kä kapi̱llari̱ böltɛj kɛnɛ ti̱o̱p lɛni̱ böltɛj cua kɛ la̱th kä 15 V kɛnɛ 50 V, kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱. MS data cua jiek rɛy puɔ̱thi̱tib ayɔn mödɛl (rethölucin duŋ 60,000; di̱tdɛ cuɛ cuɔ̱ŋ ɛ la tha̱a̱ŋ 10 kä mi̱lli̱ön) rɛy di̱tdɛ rɛŋ duŋ 300/m/z di̱tdɛ/ca̱rji̱ rɛci̱ö (m/z) 3000. Kä MS/MS data cua jiek kɛ rɛy ayɔn trap min nhiam kä XLthe Orbit, kɔlliciɔn inducid di̱thöciëcin (CID)].
MD thi̱mulɛciɔni̱ cua kɛ la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ GROMACS (52) thɔpwɛɛr kɛnɛ MARTINI 2 puɔɔth pi̱e̱l (53-55). Kä CHARMM GUI Membɛrɛn Buildɛr (56, 57) cua la̱t kɛ kɔrɛ kɛ ta̱th bai̱lɛyɛr min tekɛ di̱öleöilpöthpatidalkölin (DOPC) kɛnɛ Ther C18 kiɛ DOPC kɛnɛ Ther C26. Kä töpölöji̱ kɛnɛ kɔrdi̱nɛtni̱ duŋ Cer C26 kɛn jiëkɛ kɛ kä DXCE ɛ wuɔ̱ckɛ ɛktra bi̱i̱dni̱ kä juc i̱thpiŋöthin. La̱tdɛ ta̱a̱ in ca lat piny kɛ pääri̱ lɛyɛrä rɛw kɛnɛ ɣöö bɛ lät, kɛ kɔrɛ lätdɛ kɔrdi̱nɛtni̱ tin jɔak kä thi̱thtɛm kɛ ta̱th thi̱thtɛmä min tekɛ Emp24. Kä tra̱ni̱thmembi̱ran dɔmiɛn duŋ yi̱th Emp24 (rɛthi̱duëli̱ 173 ɛ wä kä 193) cua la̱t cie α-ɣeli̱dh kɛ la̱tdɛ kɛɛ bithual MD (VMD) tool möli̱ki̱öl i̱thtra̱kciɛr (58). Kɛ kɔrɛ, kɛ kɔr kä mëë caa lipidni̱ tin ci̱ rɔ̱ mat woc, ɛn prɔti̱i̱n cua granulated ɛ la mi̱ ci̱ rɔal kä cua la̱th rɛy bailɛyɛrä kɛ la̱tdɛ kɛɛ CHARMM GUI. Kä thi̱thtɛm in jɔak tëkɛ 1202 DOPC kɛnɛ 302 Cɛr C26 kiɛ 1197 DOPC kɛnɛ 295 Cɛr C18 kɛnɛ Emp24. Ai̱önaidhe thi̱thtɛm ɛ wä kä kɔncentrɛciɔn duŋ 0.150M. Cua ti̱ ŋuan ti̱ cuŋ kärɔ̱ la̱t kɛ kui̱ bailɛyɛri̱ kɔmpi̱öcini̱ rɛw.
Kä lipid bai̱layɛr ɛ mi̱ ca pa̱a̱r kɛ la̱tdɛ kɛɛ CHARMM GUI prötheth, min mat ni̱ ɣöö ba kulɛ jakä kuiy kɛnɛ ɣöö ba thɛm kɛ ka̱a̱th ti̱ 405,000, gua̱th in bi̱ gua̱a̱th in ca gaŋ ɛ wä piny ɛ määth kɛnɛ ɣöö ba woc, kɛnɛ ɣöö ɛn thaak ka̱a̱th bɛ rɔ re̱p ɛ tokɛ kä 0.005 ps ɛ wä kä 0.02 ps. Kɛ kɔr i̱kui̱li̱brɛciɔn, jɛn bɛ nööŋni̱ 6 μs kɛ thaak ka̱a̱th mi̱ 0.02 ps. Kɛ kɔr kä mëë ca Emp24 la̱th thi̱n, lätdɛ kɛɛ CHARMM GUI mi̱ cäät kɛ min jak thi̱thtɛm kä kuiy kɛnɛ päärɛ, kä kɛ kɔrɛ bɛ lät kɛ 8 s rɛy la̱tdɛ.
Kɛ kui̱ thi̱thtɛmni̱ diaal, rɛy la̱t ba̱lanciŋä, ɛn pi̱rɛjɛr ɛ mi̱ la gaŋkɛ ɛ Berendthen baröthtat (59), kɛnɛ rɛy la̱t pröda̱kciɔn, ɛn pi̱rɛjɛr ɛ mi̱ la gaŋkɛ ɛ Parrinellö-Rahman baröthtat (60). Rɛy gua̱thni̱ diaal, ɛn aberig pi̱rɛjɛr ɛ 1 bar kɛnɛ ɣöö ɛ themi-ai̱thötropik pi̱rɛjɛr kɔppiŋ i̱thki̱ɛm ɛ mi̱ lät. Rɛy ba̱lanci̱ kɛnɛ pröda̱kciɔn prötheth, ɛ thermöthtat (61) kɛ pɛ̈th ri̱kali̱brɛciɔn ɛ mi̱ lät kɛ mat lëthä prötien, lipid kɛnɛ thɔlbɛn pa̱rti̱käli̱ kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱. Rɛy la̱tdɛ kɛɛliw, ɛn targɛt lëthdɛ ɛ 310K. Kä nɔ̱n-böndiŋ interɛkcin ɛ mi̱ ca kalculët kɛ no̱o̱ŋdɛ kɛ pairi̱ li̱th kɛ la̱tdɛ kɛɛ Verlet i̱thki̱ɛm kɛ 0.005 bupper tölɛran. Kä tääm Kuulomb cua kalculët kɛ la̱tdɛ kɛɛ riakciɔn pi̱e̱l kɛnɛ ŋuɔ̱k-ɣɔ̱p na̱nä duŋ 1.1 nm. Kä Vander Waals tääm lätdɛ kɛɛ kat-ɔp i̱thkiɛm kɛ kat-ɔp na̱n mi̱ 1.1 nm, kɛnɛ Verlet kat-ɔp i̱thkiɛm ɛ mi̱ lät kɛ kui̱ kä ɣöö bɛ rɔ yuɔr piny (62).
Mi̱ la̱tkɛ VMD, ɛn wɛblɛŋthi̱ min ca ŋok kam DOPC pöthpët bi̱i̱dni̱ kiɛ thɛramid AM1 bi̱i̱dni̱ kɛnɛ prötien ɛ 0.7 nm, kɛnɛ ɣöö ba nämbär lipidni̱ tin röm kɛ prötien kulɛ kalculët. Kɛ min ca lar ɛ puɔrmula in guɔ̱r kɛrɔ̱, kuɛn depleciɔn-enri̱ci̱mɛn (DE) paktɔr cie min te rɛy (63): DE paktɔr = (ɛ pek lipidni̱ diaal rɛy prötien 0.7) rɛy prötien 0.7 (ɛ pek Cer rɛy lipidni̱ diaal)
Kä ba̱li̱ö min ca lat cua jiek cie aberig, kɛnɛ ɣöö ɛn error barni̱ kɛn kɛ kɔpi̱ni̱ ŋuaan ti̱ cuŋ kärɔ̱ kä SE. Kä i̱thtathti̱thtikal thi̱gni̱pi̱kan duŋ DE paktɔr ɛ mi̱ ca kalculët ɛ t thëm [(aberigDE-paktɔr-1)/SE]. Kä kalkulɛt P ba̱li̱ö min bä kä kɛl-tailed di̱thti̱ri̱buciɔn.
Kä GROMACS tool cua la̱t kɛ kalkulɛciɔn 2D latɛral denthi̱ti̱ map duŋ thi̱thtɛm min te Emp24 rɛydɛ ɛn 250 ns min jɔak kä trace. Kɛ ɣöö ba enri̱cimɛn/depleciɔn map duŋ thɛrami̱d jiek, ɛn denthi̱ti̱ map duŋ Cer ɛ mi̱ ca da̱a̱k kɛ mat mapä duŋ Cer kɛnɛ DOPC, kɛ kɔrɛ ba da̱a̱k kɛ kɔncentrɛciɔn duŋ Cer rɛy pua̱a̱ny. Kä i̱thkiɛl mapä mi̱ cäät kɛ biɛldɛ cua la̱t.
Kɛ kui̱ ŋɔaani̱ tin kɔ̱ŋ tin ba gɔ̱r piny kɛ kui̱ ruac ɛmɛ, guic http://adbances.sciencemag.org/cgi/kɔntɛnt/full/6/50/eaba8237/DC1.
Nɛmɛ ɛ wargak mi̱ ca lɛp mi̱ ca da̱a̱k piny ŋuɔ̱tni̱ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, min nhɔk ɣöö ba la̱th lät, ba da̱a̱k kɛnɛ nyɔk kɛ lätni̱ rɛy duɔ̱p mi̱ dɔ̱ŋ, mi̱ ci̱ la̱tdɛ min jɔak /ciɛ kui̱ kä ɣöö ba kɔmmerciali̱ jiek kä min ca lat i̱ la̱tdɛ min nhiam ɛ mi̱ cuŋ. Min na̱ŋkɛ thuɔ̱k thin.
Ŋäc: Kɔn thiëc nɛy ji̱ kärɔa ɛn ɣöö biɛ la̱th kä email address kɛ ɣöö bi ram min ci la̱th lät ŋa̱c ɛn ɣöö go̱ri ɣöö bɛ emaildu nɛn kä /ciɛ spam. /Ci̱ nɛy ɛ bi käp kɛ email addressni̱.
Thiec ɛmɛ lätdɛ kɛ ɣöö ba ji̱ thɛm mi ɛ ji̱n ram mi ci ben kä ba ji̱ gaŋ kä ɣöö biɛ la̱th lät.
Thöpia Rödriguedh-Gallardö, Kadhuö Kurökawa, Thuthana Thabidö-Bödhö, Alejandrö Kɔrtɛth · Gömedh (Alejandrö Kɔrteth-Gömedh), Athukö Ikeda (Athukö Ikeda), Balɛria Dhöni̱ (Balɛria Dhöni̱), Audhi̱liadöra Aguilera-Römerö, Ana Maria Peredh Löɣödhöpe -Linerö), Waga), Mithakö Arman (Mithakö Arman), Miyakö Riman (Miyakö Riman), Pröw Akira, I̱thtɛpanö Pänni̱, Akiɣikö Nakanö, Manuel Muni̱dh
3D ɣai̱-rethölucin ri̱i̱l-tai̱m i̱mëjiŋ cuɛ nyoth ɛn min gɔa kä thɛrami̱de cɛɛn lɛŋthi̱ kɛ kui̱ prötien thɔ̱rtiŋ rɛy thɛlɛktib autput thayti̱ni̱.
Thöpia Rödriguedh-Gallardö, Kadhuö Kurökawa, Thuthana Thabidö-Bödhö, Alejandrö Kɔrtɛth · Gömedh (Alejandrö Kɔrteth-Gömedh), Athukö Ikeda (Athukö Ikeda), Balɛria Dhöni̱ (Balɛria Dhöni̱), Audhi̱liadöra Aguilera-Römerö, Ana Maria Peredh Löɣödhöpe -Linerö), Waga), Mithakö Arman (Mithakö Arman), Miyakö Riman (Miyakö Riman), Pröw Akira, I̱thtɛpanö Pänni̱, Akiɣikö Nakanö, Manuel Muni̱dh
3D ɣai̱-rethölucin ri̱i̱l-tai̱m i̱mëjiŋ cuɛ nyoth ɛn min gɔa kä thɛrami̱de cɛɛn lɛŋthi̱ kɛ kui̱ prötien thɔ̱rtiŋ rɛy thɛlɛktib autput thayti̱ni̱.
©2020 Aththöciacin Amëri̱ka kɛ kui̱ kä ɣöö ba Thaany rep. cuŋ diaal ca kɛ tɔ̱w. AAAS ɛ ram kɛl kä HINARI, AGORA, OARE, CORUS, CLOCKSS, CrossRep kɛnɛ COUNTER. ThaanyAdbanthni̱ ISSN 2375-2548.