Immi̱o̱nömödulatöri̱ metɛbölai̱teth kɛn kɛ ti̱ di̱t kä tuɔm mai̱kröenba̱rɔnmɛn (TME), duŋni̱ ɣöö kɛ tha̱a̱ŋkiɛn ti̱ ca woc, ŋiecdiɛn cuɛ ŋot ɛ mi̱ kueckɛ ɛlɔ̱ŋ. Ɛn wa̱nɛ, cua ti̱o̱muɔri̱ kɛnɛ T thëlli̱ diel guec kä ti̱o̱muɔri̱ kɛnɛ aththi̱teth duŋ jua̱thni̱ tin tekɛ ɣai̱-grɛd thi̱ra̱th karthi̱nöma (HGSC) kɛ nyuɔ̱th mɛtabölöme duŋ TME kɔmpa̱rti̱mɛni̱ ti̱ti̱ ti̱ gööl. Athciteth kɛnɛ tuɔm thëlli̱ tekɛ dääk mi̱ di̱i̱t kä metɛbölai̱te. Mi̱ pa̱a̱rkɛ jɛ kɛ aththi̱teth, ɛn tuɔm-inpiltretiŋ T thëlli̱ kɛn kɛ ti̱ ŋuan ti̱ ci̱ rɔ̱ rep rɛy 1-methi̱lnikötinamaid (MNA). Cieŋni̱ min ɛn lɛbel duŋ MNA rɛy T thëlli̱ cɛ rɔ jiɛc nhial, ɛn latdɛ duŋ nikötinamaid N-methyltranthperɛth (ɛ endhɛm min jak buɔ̱n methyl kä S-adenothai̱lmethionain ɛ wä kä nikötinamaid) jɛn tëkɛ guut kä pai̱bröbla̱thni̱ kɛnɛ tuɔm thëlli̱. Pa̱ŋciɔnali̱, MNA la T thëlli̱ ɛ jakä ɣöö bi̱kɛ ti̱o̱m-prömötiŋ thai̱tökain ti̱o̱m nekröthi̱th paktɔr alpa woc. Kɛ kui̱c ɛmɔ, TME-in jiɛn kä MNA cuɛ luäk kɛ riali̱ pua̱a̱ny ran kä T thëlli̱ kɛnɛ ɣöö cuɛ cuɔ̱ŋ ɛ la mi̱ bi̱ buɔ̱m i̱mmi̱o̱nötherapi̱ targɛt kɛ jak ka̱nthɛrä ran kä gɔaa.
Tumɔr-deri̱bɛd metɛbölai̱teth bɛ tekɛ ini̱bi̱töri̱ mi̱ di̱i̱t mi̱ cɛ nööŋ kä anti̱-tumɔr immi̱o̱ni̱ti̱, kɛnɛ ɣöö cuɛ tekɛ cäätni̱ ti̱ ŋuan kä ti̱ ŋuan ti̱ nyothɛ jɛ i̱ kɛn bä de kɛn lät cie mi̱ ɛ buɔ̱m mi̱ di̱i̱t kɛ rëp jua̱thni̱ (1). Ɛ matkɛ nɛmɛ thi̱n kä Warburg i̱pɛkt, la̱t mi̱ thi̱a̱k cuɛ tok kɛ ciɛŋ metɛbölik wec duŋ tumä thëlli̱ kɛnɛ maardɛ kɛ ta̱a̱ in gaŋkɛ rɔ kä tuɔm mai̱kröenba̱rɔnmɛn (TME). Ŋi̱i̱cni̱ kä mödɛli̱ muɔth kɛnɛ T thëlli̱ ran cua nyoth i̱ glutamine mëtaböli̱dhi̱öm (2), ɣɔkdhi̱dɛtip mëtaböli̱dhi̱öm (3) kɛnɛ glukööth mëtaböli̱dhi̱öm (4) de kɛn lät kärɔ̱ kä tha̱bgurupni̱ thëlli̱ i̱mmi̱o̱n ti̱ gööl. Metɛbölai̱teth ti̱ ŋuan rɛy dupni̱ ti̱ti̱ gaŋkɛ la̱t anti̱-tumɔr duŋ T thëlli̱. Jɛn cua nyoth i̱ jɛn blökɛd duŋ köendhaim tetraɣai̱dröbaöpterin (BH4) bɛ pröli̱perɛciɔn duŋ T thëlli̱ ya̱r, kɛnɛ rëp BH4 rɛy pua̱a̱ny bɛ anti̱-tumɔr immi̱o̱n ri̱thpɔn jakä bum mi̱ ca nööŋ ɛ CD4 kɛnɛ CD8. Ɛ matkɛ nɛmɛ thi̱n, ɛn immi̱o̱nöthɔ̱ppreththib ëpɛkt duŋ kai̱nureninain dɔ̱ŋ ba luäk ɛ läth BH4 (5). Rɛy ai̱thöthi̱trɛt deɣai̱dröjenathe (IDH) mutant gli̱öbla̱thtöma, kä thɛkrɛciɔn duŋ enantiömetabolik (R)-2-ɣaidrökthi̱glutarate (R-2-HG) la T thëll ɛ gaŋɛ lät, pröli̱perɛciɔn kɛnɛ thai̱töli̱thi̱th Ɛkti̱bɛciɔn (6). Ɛ thia̱kɛ, jɛn cua nyoth i̱ methylglyoxal, ɛ bai-pröda̱k duŋ glaiköli̱thi̱th, ɛ mi̱ la nööŋkɛ ɛ suppreththɔr thëlli̱ nyin mai̱löid orijin, kɛnɛ T thëll mi̱ naŋkɛ kä methylglyoxal bɛ i̱pɛktɔr T thëll pa̱ŋciɔn gaŋ. Rɛy wal, ɛn neutrali̱dhëcin duŋ methylglyoxal bɛ lät nyin mai̱löid-deri̱bed thuppreththɔr thëlli̱ (MDSC) luäŋ kɛ wuɔ̱c kɛnɛ thai̱nerji̱thti̱kalli̱ min bi̱ checkpoint blökɛd thera̱pi̱ jakä di̱t rɛy mödɛli̱ muɔth (7). Ŋi̱i̱cni̱ ti̱ti̱ kɛɛl cukɛ guic ni̱ la̱t in di̱tni̱ jɛn kä TME-derived metɛbölai̱teth rɛy riali̱ T thëll i̱kä kɛ lät kɛnɛ lätkɛ.
T thëll di̱thpa̱ŋciɔn cua lat ɛlɔ̱ŋ rɛy öbarian ka̱nthɛr (8). Nɛmɛ ɛ tha̱a̱ŋdɛ kɛ kui̱ ciɛŋni̱ mɛtɛbölik tin tä rɛy ɣai̱pɔdhia kɛnɛ abnɔrmal ti̱o̱m ba̱thkulaciɛr (9), min laa bëë raar ɛ la glukööth kɛnɛ trai̱ptöpan ɛ la tin laa nööŋkɛ ciee kɛ laktik athid kɛnɛ kainurɛnain. Ɛktrathëllular laktɛt mi̱ di̱i̱t la jakɛ interperɔn-γ (IFN-γ) kä kuiy kɛnɛ ɣöö bɛ dääk kam mai̱löthɔ̱pprethib tha̱bgurupni̱ jakä kuiy (10, 11). Kä mi̱eth trai̱ptöpan la gaŋɛ T thëll pröli̱perɛciɔn kɛnɛ ɣöö la T thëll ri̱thɛptɔr thi̱knaliŋ ɛ gaŋɛ (12-14). Cieŋni̱ min guäc kɛn ti̱ti̱, la̱t mi̱ di̱i̱t mi̱ ci̱ rɔ go̱l kä immi̱o̱n metɛböli̱dhi̱öm cua la̱t rɛy bi̱trö T thëll ka̱lciɛr kɛ la̱tdɛ kɛɛ öpti̱maidhed mi̱diaa, kiɛ mi̱ ca ŋok kä ɣömölöga̱th muɔth mödɛli̱ rɛy bi̱bö, /thiɛlɛ mi̱ nyoothɛ ni̱ ɣe̱ti̱röjenei̱ti̱ duŋ ka̱nthɛri̱ raanä kɛnɛ Pi̱i̱thi̱ölöji̱kal makrö kɛnɛ mai̱krö enba̱rɔnmɛn.
Ɛn min ŋa̱ckɛ kä ka̱nthɛr öbarian ɛ däk piny kä peritönial kɛnɛ jɔac athciteth. Kä ruuli̱ thëll pi̱i̱ni̱ rɛy athciteth ɛ mi̱ thi̱ääk kɛ juey mi̱ ci̱ räth kɛnɛ prögni̱thi̱th mi̱ jiääk (15). Kɛ mëë ca lar ɛ lääri̱, ɛn kɔmpa̱rti̱mɛn ɛmɛ min rɛlrɔ ɛ ɣai̱pödhik, tëkɛ lɛbeli̱ ti̱ di̱t kä ba̱thkular endöthelial pi̱e̱th paktɔr (VEGF) kɛnɛ indöliamin 2,3-dai̱ɣɔkthi̱jenathe (IDO), kɛnɛ ɣöö ɛ mi̱ ca la̱th rɛy T regulatɔri̱ thëlli̱ kɛnɛ mai̱löid ini̱bi̱töri̱ thëlli̱ (15-18). Kä gua̱th in te metɛbölik thi̱n kä aththi̱teth dɔ̱ŋ bɛ tekɛ dääk kɛ min tekä ti̱o̱m kärɔa, bä ɛn reprögra̱mmiŋ duŋ T thëlli̱ rɛy peritönial i̱thpëth ɛ mi̱ /ci̱ jɔc. Ɛ nyɔk bä, ɛn dääk in di̱i̱t kɛnɛ ɣe̱ti̱röjenei̱ti̱ kam aththi̱teth kɛnɛ metɛbölai̱teth tin te rɛy gua̱th in te ti̱o̱m thi̱n dɔ̱ŋ bɛ cu gaŋ ni̱ ɣöö bi̱ thëlli̱ i̱mmi̱o̱n rɔ̱ wä rɛc kɛnɛ la̱tdiɛn kä ti̱o̱mni̱, kɛnɛ ɣöö ba ri̱thääc mi̱ dɔ̱ŋ go̱r.
Rɛy riali̱ rikni̱ ti̱ti̱ i̱kä, cua kɔn riali̱kä kɛ thɛnthi̱ti̱b thëlli̱ dääk kɛnɛ li̱kuid krömatögra̱pi̱ tandem ma̱th i̱thpekti̱römeti̱ri̱ (LC-MS/MS) methɔd kɛ ŋi̱i̱c thëlli̱ ti̱ gööl (cu määni̱ CD4 + kɛnɛ CD8 + T thëlli̱) cie mi̱ cie rɛydɛ kɛnɛ kam ti̱o̱muɔri̱ Jɛn metɛbölai̱teth i̱thpan thëlli̱ rɛy athciteth mi̱ cäät kɛnɛ gua̱a̱th in te juey thi̱n. Kɔn la̱tnɛ ca̱p ɛmɛ kɛɛl kɛ ɣai̱-dai̱mɛncinal plöw thai̱tömetri̱ kɛnɛ thi̱ŋgil-thëll RNA thi̱kuɛnthiŋ (scRNA-thek) kɛ ŋundɛ kɛɛ thurɛ mi̱ ca riali̱kä mi̱ di̱i̱t kä ta̱a̱ metɛbölik duŋ puɔ̱pulëcini̱ ti̱ti̱ tin di̱t. Methɔɔd ɛmɛ cuɛ nyoth i̱ cuɛ rɔ rep ɛ lɔ̱ŋ rɛy lɛbel duŋ 1-methylnikötinamaid (MNA) rɛy tumä T thëlli̱, kɛnɛ rɛy bi̱trö ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ cuɛ nyoth i̱ jɛn immi̱o̱nömödulatöri̱ ëpɛkt duŋ MNA kä T thëll pa̱ŋciɔn cuɛ tekɛ mi̱ kueckɛ ni̱ wal. Rɛydɛ kɛɛliw, ɛn ca̱p ɛmɛ nyothɛ ta̱a̱ in lät kɛ mɛtabölik kam ti̱o̱muɔri̱ kɛnɛ i̱mmi̱o̱n thëlli̱, kɛnɛ ɣöö ŋunɛ ŋäc mi̱ rɛlrɔ rɛy i̱mmi̱o̱n regulɛciɔn metɛbölai̱teth, min dɔ̱ŋ bɛ gɔa kɛ jak T thëll-bɛth öbarian ka̱nthɛr immi̱o̱nötherapi̱ kä gɔaa kɛ jakdɛ kä gɔaa.
Cu nɛy lät kɛ ɣai̱-dai̱mɛncinal plöw thai̱tömetri̱ kɛ gua̱a̱th kɛl kɛ kui̱ glukööth min ca naŋ [2-(N-(7-nai̱tröpenyl-2-ɣɔktha-1,3-diadha-4-il)ami̱nö)-2-deɔkthi̱glukööth (2-NBDG) kɛnɛ mai̱tökɔndi̱rial ɛkti̱bi̱ti̱ kɛn [MitöTrakɛr Deep Red,MT7de1) tipikal markɛri̱ tin dääk thëlli̱ immi̱o̱n kɛnɛ tuɔm thëlli̱ puɔ̱pulëcini̱ (Table S2 kɛnɛ Thurɛ S1A). Anali̱thi̱th ɛmɛ cuɛ nyoth i̱ mi̱ pa̱a̱rkɛ kɛ T thëlli̱, athciteth kɛnɛ tuɔm thëlli̱ tekɛ glukööth mi̱ di̱i̱t mi̱ naŋkɛ ni̱ jɛ, duŋni̱ ɣöö tekɛ dääk mi̱ tɔt rɛy läätdä mai̱tökɔndi̱rial. Kä aberig glukööth min naŋkɛ kä tuɔm thëlli̱ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ɛ mi̱ ci̱ rɔ rep ni̱ kä diɔ̱k ɛ wä kä ŋuaan kä T thëlli̱, kɛnɛ ɣöö ɛn aberig glukööth min naŋkɛ kä CD4 + T thëlli̱ ɛ 1.2 mi̱ ci̱ rɔ rep kä CD8 + T thëlli̱, min nyoth ɣöö Tumɔr inpiltretiŋ li̱mphöthai̱teth (TIL go̱o̱rɛ saPig e) tekɛ dääk). Mi̱ gua̱c, ɛn la̱t mai̱tökɔndi̱rial rɛy thëlli̱ ti̱o̱mä cäätdɛ kɛ min lät kä CD4 + T thëlli̱, kɛnɛ ɣöö ɛn lät mai̱tökɔndi̱rial kä thëlli̱ da̱ŋ rɛw ɛ mi̱ di̱tni̱ jɛn kä CD8 + T thëlli̱ (Pi̱guur 1B). Rɛydɛ kɛɛliw, kɛn tin ci̱ ben raar nyothkɛ lɛbel metɛbölik. Kä lät mɛtabölik kä thëlli̱ tumä di̱tdɛ ɛlɔ̱ŋ mi̱ läny min tekä CD4 + T thëlli̱, kɛnɛ ɣöö min lät mɛtabölik kä CD4 + T thëlli̱ di̱tdɛ ɛlɔ̱ŋ mi̱ läny min tekä CD8 + T thëlli̱. Cieŋni̱ min tekɛ ti̱ti̱ ti̱ ci̱ tuɔɔk rɛy thëlli̱ ti̱ gööl, cuɛ thiɛl dääk mi̱ cuŋ rɛy ta̱a̱ mɛtabölik duŋ CD4 + kɛnɛ CD8 + T thëlli̱ kiɛ ta̱a̱diɛn in thi̱ääk rɛy aththi̱teth mi̱ pa̱a̱rkɛ kɛ ti̱o̱muɔri̱ (Pi̱guur 1C). Mi̱ gua̱c, rɛy CD45-thëll pi̱rɛkcin, ɛn pröpörciɔn duŋ EpCAM+ thëlli̱ rɛy ti̱o̱mä cuɛ rɔ re̱p mi̱ pa̱a̱rkɛ jɛ kɛ aththi̱teth (Pi̱guur 1D). Cu nɛy ɛ guic bä ɛn dääk metɛbölik mi̱ jɔc kam EpCAM+ kɛnɛ EpCAM- thëll kɔmpönɛni̱. EpCAM+ (tumɔr) thëlli̱ tekɛ glukööth mi̱ di̱i̱t mi̱ naŋkɛ kɛnɛ lät mai̱tökɔndi̱rial mi̱ läny EpCAM- thëlli̱, min di̱tni̱ jɛn ɛlɔ̱ŋ mi̱ läny lät metɛbölik duŋ pai̱bröbla̱thni̱ rɛy tumɔr thëlli̱ rɛy TME (Pi̱guur 1, E kɛnɛ F).
(A kɛnɛ B) Median pluorethcen intenthi̱ti̱ (MFI) duŋ glukööth aptɛk (2-NBDG) (A) kɛnɛ mai̱tökɔndi̱rial ɛkti̱bi̱ti̱ duŋ CD4 + T thëlli̱ (MitöTrakɛr mi̱lual mi̱ tɔ̱c) (B) Reprethetib gi̱ra̱pni̱ (caam) kɛnɛ tabulated data ni̱ (Cuec), CD8 + T thëlli̱ kɛnɛ EpCAM + T thëlli̱ kɛnɛ EpCAM + T thëlli̱ kɛnɛ EpCAM + CD45-. (C) Kä rɛci̱ö duŋ CD4 + kɛnɛ CD8 + thëlli̱ (duŋ CD3 + T thëlli̱) rɛy aththi̱teth kɛnɛ ti̱o̱m. (D) Pröpörciɔn duŋ EpCAM + ti̱o̱m thëlli̱ rɛy aththi̱teth kɛnɛ ti̱o̱m (CD45−). (E kɛnɛ F) EpCAM + CD45-tumɔr kɛnɛ EpCAM-CD45-matrik glukööth aptɛk (2-NBDG) (E) kɛnɛ mai̱tökɔndi̱rial ɛkti̱bi̱ti̱ (MitöTrakɛr mi̱ lual mi̱ tɔ̱c) (F) cuŋkɛ gi̱ra̱pni̱ (caam) kɛnɛ data ni̱ tin ca tabulɛted (Cuec) Athciteth kɛnɛ tumɔr thëlli̱. (G) Cuŋkɛ ɛ la gi̱ra̱pni̱ duŋ CD25, CD137 kɛnɛ PD1 latdɛ kɛɛ plöw thai̱tömetri̱. (H kɛnɛ I) CD25, CD137 kɛnɛ PD1 latdɛ kä CD4 + T thëlli̱ (H) kɛnɛ CD8 + T thëlli̱ (I). (J kɛnɛ K) Naive, thäntral mɛmöri̱ (Tcm), i̱ppɛktɔr (Teff) kɛnɛ i̱ppɛktɔr mɛmöri̱ (Tem) pënötaapni̱ min tekä latdɛ duŋ CCR7 kɛnɛ CD45RO. Thurɛni̱ tin cuŋ kɛ kui̱dɛ (caam) kɛnɛ data ni̱ tabular (cuec) duŋ CD4 + T thëlli̱ (J) kɛnɛ CD8 + T thëlli̱ (K) rɛy aththi̱teth kɛnɛ ti̱o̱muɔri̱. P ba̱liömmi̱ cua kɛ jiek ɛ t-thɛm mi̱ ca mat kɛɛl (*P<0.05, **P<0.01 kɛnɛ ***P<0.001). Kä bëër cuŋɛ la jua̱th tin ca mat (n = 6). FMO, pluorethcen mi̱ naŋkɛ kɛl; MFI, median pluorethcen intenthi̱ti̱.
Anali̱thi̱th mi̱ dɔ̱ŋ cuɛ dääk mi̱ di̱i̱t nyoth kam T thëll pënötai̱pik i̱thta̱th ëë ca riali̱kä ɛlɔ̱ŋ. Kä min ca lät (Pi̱guur 1, G ɛ wä kä I) kɛnɛ i̱ppɛktɔr mɛmöri̱ (Pi̱guur 1, J kɛnɛ K) rɛy ti̱o̱muɔri̱ kɛn la tuɔɔkɛ ɛlɔ̱ŋ mi̱ läny aththi̱teth (pröpörciɔn duŋ CD3 + T thëlli̱). Päärɛ, anali̱thi̱th duŋ pënötaap ɛ latdɛ duŋ ɣɛkti̱bɛciɔn markɛri̱ (CD25 kɛnɛ CD137) kɛnɛ depleciɔn markɛri̱ [prögi̱ra̱mɛd thëll death prötien 1 (PD1)] cuɛ nyoth i̱ cieŋni̱ min ciɛŋ metɛbölik nyin puɔ̱pulëcini̱ ti̱ti̱ tekɛ dääk (Pi̱guur S1, B ɛ wä kä E) , Duŋni̱ ɣöö cuɛ thiɛl mi̱ cua ŋa̱c mi̱ cu dääk metɛbölik i̱pɛkt kam naPi̱guur S1, F ɛ wä kä I). Kä tëë ci̱ ben raar cua kɛ ŋa̱c kɛ la̱tdɛ kɛɛ ca̱p ŋi̱i̱cä maciinä kɛ läthdɛ lät kärɔa kɛ thëll pënötaapni̱ (21), min cuɛ räth ni̱ kä ɣöö cuɛ nyoth i̱ tekɛ nämbär mi̱ di̱i̱t kä thëlli̱ cɔ̱ɔ̱ni̱ (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) rɛy aththi̱teth duŋ jua̱th (Pi̱guur S2A ). Rɛy thëlli̱ diaal tin ca ŋa̱c, ɛn mai̱löid thëll puɔ̱pulëcin ɛmɛ cuɛ glukööth mi̱ di̱i̱t nyoth kɛnɛ lät mai̱tökɔndi̱rial (Pi̱guur S2, B ɛ wä kä G). Ti̱ti̱ cukɛ ben raar kɛ dääk metɛbölik mi̱ bum kam thëlli̱ ti̱ ŋuan ti̱ ca jiek rɛy aththi̱teth kɛnɛ ti̱o̱muɔri̱ rɛy HGSC jua̱thni̱.
Kä riɛk in di̱tni̱ jɛn rɛy ŋäcä ciɛŋni̱ metabonömik duŋ TIL ɛ jɛn min görkɛ i̱ ba T thëll tha̱mpuɔli̱ woc ti̱ ro̱ŋ ti̱ wicwic, gɔɔydiɛn kɛnɛ kua̱nti̱ti̱diɛn kä ti̱muɔri̱. Ŋi̱i̱cni̱ ti̱ thi̱a̱k cua nyoth i̱ thɔ̱rtiŋ kɛnɛ bead enri̱ci̱mɛn methɔd min lät kä plöw thai̱tömetri̱ dɔ̱ŋ bɛ cu nööŋni̱ gër rɛy thëllular metɛbölai̱te pröpai̱li̱ (22-24). Mi̱ görkɛ ɣöö ba riɛk ɛmɛ luäŋ kɛ wuɔ̱c, cua ca̱p in la la̱thkɛ lät ɛ gɔaa kɛ kui̱ kä ɣöö ba TIL woc kɛnɛ ɣöö ba TIL woc kä thärji̱kalli̱ min ca woc kä ka̱nthɛr öbarian ran ɛ ŋot känɛ ni̱ anali̱thi̱th ɛ LC-MS/MS (guic Materiali̱ kɛnɛ Methɔdni̱; Thurɛ 2A). Rɛy kä ɣöö ba min ci̱ tuɔɔk kɛɛliw kä prötökɔɔl ɛmɛ ŋa̱c kä gër metɛbölai̱te, cua kɔn päär kɛ metɛbölai̱te pröpai̱li̱ nyin T thëlli̱ tin ca la̱t ɛ dönɛri̱ tin puɔl pua̱nykiɛn kɛ kɔr ka̱a̱th in ca lat nhial kɛ dääk beadni̱ kɛ thëlli̱ tin /ka̱n bead da̱a̱k duŋni̱ ɣöö cukɛ duɔth kä ɣacä. Kuali̱ti̱ kɔnti̱röl anali̱thi̱th ɛmɛ cuɛ jiek ɛn ɣöö tëkɛ röm mi̱ di̱i̱t kam kɔndi̱ciɔni̱ rɛw ti̱ti̱ (r = 0.77), kɛnɛ ɣöö ɛn tɛkni̱kal ri̱pi̱ti̱bi̱li̱ti̱ duŋ bunä duŋ 86 metɛbölai̱teth tëkɛ ri̱pi̱ti̱bi̱li̱ti̱ mi̱ di̱i̱t (Pi̱guur 2B). Kɛ kui̱c ɛmɔ, ca̱a̱p ti̱ti̱ bi̱ kɛn metɛbölai̱te anali̱thi̱th mi̱ thuɔ̱k la̱t rɛy thëlli̱ tin wä rɛy thëll ta̱a̱diɛn mi̱ ci̱ rɔ rep, kɛ kɔrɛ bɛ cu nööŋni̱ plathpuɔm in nhiam mi̱ tekɛ ri̱thɔ̱lucin mi̱ di̱i̱t kɛ ŋi̱e̱c metɛbölai̱teni̱ ti̱ caa lɛy rɛy HGSC, kɛ kui̱c ɛmɔ bɛ naath jakä bi̱ ŋäc mi̱ di̱i̱t jiek kä thëll i̱thpethi̱pi̱ci̱ti̱ Thɛkcuɔl mɛtaböli̱dhi̱öm prögi̱ra̱m.
(A) I̱thki̱ɛmatik diagram duŋ magnɛtik bi̱i̱d enri̱cimɛn. Ɛ ŋot /ka̱nɛ ni̱ diel guec ɛ LC-MS/MS, kɛn thëlli̱ bi̱ kɛ wä rɛy ro̱undni̱ diɔ̱k ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱ kä magnɛtik bi̱i̱d enri̱cimɛn kiɛ bi̱ kɛ cu duɔth kä ɣaci̱. (B) Kä min no̱o̱ŋ ta̱a̱ enri̱ci̱mɛn kä ŋuan metɛbölai̱teth. Kä aberig duŋ thëm diɔ̱k kɛ kui̱ enri̱cimɛn ta̱a̱ kärɔa ± SE. Kä bëër tin bo̱r cuŋɛ la 1:1 maar. Kä intra-ki̱la̱th kɔrrelɛcin (ICC) duŋ thëm in ca nyɔk kɛ lätni̱ cua nyoth rɛy ɣɛkdhi̱t lɛbelä. NAD, ni̱kötinamaid adenain daini̱ki̱lötaid. (C) I̱thki̱ɛmatik diagram duŋ läätdä duŋ jua̱thni̱ metɛbölai̱te anali̱thi̱th. Athciteth kiɛ ti̱o̱mni̱ kɛn cua kɛ ruuli̱ kä jua̱th kɛnɛ ɣöö cua kɛ la̱th kä krayöprethärbɛd. Ɛn tha̱a̱ŋ tha̱mpuɔlä kɛl cua kɛ die̱l guäc ɛ plöw thai̱tömeti̱ri̱, niɛ gua̱a̱ mɔ tha̱mpuɔli̱ tëë ci̱ duɔth cua kɛ wä rɛy ro̱undni̱ diɔ̱k ti̱ cua enri̱cimɛn kɛ kui̱ CD4+, CD8+ kɛnɛ CD45- thëlli̱. Thëll pi̱rɛkcini̱ ti̱ti̱ cua kɛ die̱l guäc kɛ la̱tdɛ kɛɛ LC-MS/MS. (D) Ɣi̱th map duŋ i̱thtandardaidhed metɛbölai̱te abundancy. Kä dendrögra̱m cuŋɛ la mi̱ cuŋ ɛ la buɔ̱n Ward'ä duŋ Euclidean na̱n kam tha̱mpuɔli̱. (E) Principal kɔmpönɛnt anali̱thi̱th (PCA) duŋ tha̱mpuɔl metɛbölai̱te map, nyothɛ ni̱ tha̱mpuɔl kɛl mi̱ ci̱ rɔ luɔc kä diɔ̱k, tha̱mpuɔli̱ ti̱ bä kä jua̱th mi̱ cäät kɛn cua kɛ röm ɛ bëër. (F) Kä PCA duŋ metɛbölai̱te pröpai̱l duŋ tha̱mpuɔlä min ca kɔndiciɔn kä jua̱th (cäät, la̱tdɛ kɛɛ tha̱a̱ŋ redundanci̱); kä tha̱mpuɔl ta̱a̱dɛ ɛ mi̱ ca ŋok ɛ kɔnbɛk hul. PC1, min di̱tni̱ jɛn kä 1; PC2, min di̱tni̱ jɛn kä kɔmpönɛnt 2.
Kɛ kɔrɛ, cua ca̱p ɛmɛ la̱th lät kɛ anali̱thi̱th 99 metɛbölai̱teth rɛy CD4 +, CD8 + kɛnɛ CD45-thëll pi̱rɛkcini̱ rɛy pri̱märi̱ aththi̱teth kɛnɛ ti̱o̱muɔri̱ nyin HGSC jua̱thni̱ bäkɛl (Pi̱guur 2C, Thurɛ S3A kɛnɛ Tɛbɛl S3 kɛnɛ S4). Kä puɔ̱pulëcin min görkɛ cuɛ tekɛ 2% ɛ wä kä 70% kä tha̱mpuɔl in di̱i̱t ëë nhiam kä thëlli̱ tin tëk, kɛnɛ ɣöö ɛn pröpörciɔn duŋ thëlli̱ cuɛ tekɛ dääk mi̱ di̱i̱t kam jua̱thni̱. Kɛ kɔr kä mëë ca bi̱i̱dni̱ da̱a̱k, ɛn enri̱cid pi̱rɛkcin duŋ intɛrɛth (CD4+, CD8+ kiɛ CD45-) cuɛ tekɛ mi̱ läny 85% kä thëlli̱ diaal tin tëk rɛy tha̱mpuɔlä kä aberig. Ɛnri̱cimɛn methɔd ɛmɛ jakɛ kɔn kä anali̱thi̱th thëlli̱ puɔ̱pulëcini̱ kä yuman ti̱o̱m ti̱cu mëtaböli̱dhi̱öm, min /cɛ rɔ lot kɛ la̱t kä tha̱mpuɔli̱ ti̱ di̱t. Mi̱ la̱tkɛ prötokɔ̱l ɛmɛ, cua jiek ɛn l-kainurenine kɛnɛ adenöthin, kɛn rɛw ti̱ti̱ cua kɛ ciɛŋ-ɛ gɔaa kɛ immi̱o̱nöthɔ̱ppreththib metɛbölai̱teth cua kɛ jiɛc nhial rɛy tumä T thëlli̱ kiɛ tumä thëlli̱ (Pi̱guur S3, B kɛnɛ C). Kɛ kui̱c ɛmɔ, kɛn tin ci̱ ben raar nyothkɛ ni̱ thuɔ̱k kɛnɛ lua̱ŋ thëlli̱ kɔn kɛ dääkdiɛn kɛnɛ ma̱th i̱thpekti̱römeti̱ri̱ tɛknölöji̱ kɛ gör baölöji̱kalli̱ metɛbölai̱tethni̱ tin gɔw rɛy ti̱cuthni̱ jua̱thni̱.
Anali̱thi̱th ëë la̱tnɛ bä cuɛ nyoth ɛn dääk metɛbölik mi̱ bum kä thëlli̱ ta̱a̱diɛn rɛydɛ kɛnɛ kam jua̱thni̱ (Pi̱guur 2D kɛnɛ Pi̱guur S4A). Rɛydɛ kärɔa, mi̱ pa̱a̱rkɛ jɛ kɛ jua̱th kɔ̱kiɛn, jua̱th 70 cuɛ ciɛŋ metɛbölik ti̱ gööl nyoth (Pi̱guur 2E kɛnɛ Pi̱guur S4B), cuɛ nyoth i̱ dɔ̱ŋ bɛ tekɛ tha̱bi̱thtancial metɛbölik ɣe̱ti̱röjeni̱ti̱ kam jua̱thni̱. Ɛ mi̱ gɔaa ɛn ɣöö ba ŋa̱c ɛn ɣöö mi̱ pa̱a̱rkɛ jɛ kɛ jua̱th tin kɔ̱kiɛn (1.2 ɛ wä kä 2 li̱ti̱ri̱; Table S1), ɛn pek ascites ëë ca ruuli̱ kä jua̱th 70 (80 ml) cuɛ kuɛ̈ɛ̈. Kä kɔnti̱röl duŋ inter-pa̱thɛnt ɣe̱ti̱röjeni̱ti̱ rɛy pri̱nthi̱pal kɔmpönɛnt anali̱thi̱th (cäät, la̱tdɛ kɛɛ tha̱a̱ŋ redundanthi̱ anali̱thi̱th) nyothɛ ni̱ min la gɛɛrɔ kam thëlli̱, kɛnɛ thëlli̱ kɛnɛ/kiɛ mai̱kröenba̱rɔnmɛn kɛn cua kɛ mat kɛɛl ɛ jɔc kɛ mëë ca lar ɛ metɛbölai̱te pröpai̱l (Pi̱guur 2F). Kä anali̱thi̱th duŋ thi̱ŋgil metɛbölai̱teth cuɛ guic ni̱ ti̱ti̱ kä cuɛ nyothni̱ dääk mi̱ di̱i̱t kam thëlli̱ kɛnɛ mai̱kröenba̱rɔnmɛn. Jɛn gɔaaɛ ɛn ɣöö ba ŋa̱c ɛn dääk in di̱tni̱ jɛn min ca guic ɛ MNA, min ni̱ ciaaŋ la thi̱ääŋ rɛy CD45- thëlli̱ kɛnɛ rɛy CD4+ kɛnɛ CD8+ thëlli̱ tin wä rɛy tumä (Pi̱guur 3A). Kɛ kui̱ CD4 + thëlli̱, ɛn min ci̱ tuɔɔk cuɛ jɔɔc ɛlɔ̱ŋ, kɛnɛ ɣöö ɛn MNA rɛy CD8 + thëlli̱ bä cuɛ ce̱tkɛ mi̱ ca ya̱r ɛ bum ɛ gua̱a̱th in tekɛ thi̱n. Duŋdɛ ɣöö, nɛmɛ /cɛ gɔaa, kɛ ɣöö kɛn nɛy da̱ŋ diɔ̱k kä jua̱th da̱ŋ bäkɛl kärɔ̱ kɛn tin dëë thɛm kɛ CD8+ i̱thkɔri̱ tin tä rɛy tumä. Ɛ matkɛ nɛmɛ thi̱n kä MNA, rɛy thëlli̱ ti̱ gööl rɛy aththi̱teth kɛnɛ ti̱o̱muɔri̱, metɛbölai̱teth kɔ̱kiɛn tin /thiɛl ciɛŋkiɛn ɛ gɔaa rɛy TIL kɛn bä tekɛ dääk mi̱ riäŋ (Pi̱guri̱ S3 kɛnɛ S4). Kɛ kui̱c ɛmɔ, kɛn data ni̱ ti̱ti̱ cua thɛt mi̱ gɔa duŋ immi̱o̱nömödulatöri̱ metɛbölai̱teth nyoth kɛ kui̱ ri̱thääcä mi̱ räth.
(A) Nɔrmalaidhed kɔntɛn duŋ MNA rɛy CD4+, CD8+ kɛnɛ CD45- thëlli̱ ti̱ bä kä aththi̱teth kɛnɛ ti̱o̱m. Kä bok plɔt nyothɛ median(line), intɛrkuartil rɛŋ(pi̱rɛm ɣi̱nji) kɛnɛ data rɛŋ, ɛ wä ni̱ kä 1.5 gua̱thni̱ kä intɛrkuartil rɛŋ(pi̱rɛm wiskɛr). Cie min ca lat rɛy Patiɛn Matiriali̱ kɛnɛ Methɔdni̱, la̱tdɛ kɛɛ limma ba̱li̱ö duŋ pa̱thɛn kɛ jiek P ba̱li̱ö (*P<0.05 kɛnɛ **P<0.01). (B) I̱thki̱ɛmatik diagram duŋ MNA mɛtaböli̱dhi̱öm (60). Mɛtɛbölai̱teth: S-adenöthail-1-methiönain; SAH, S-adenöthin-1-ɣömöthi̱thtien; NA, ni̱köti̱na̱maid; MNA, 1-methi̱lni̱kötinamaid; 2-PY, 1-methi̱l- 2-pai̱ri̱dɔn-5-karböktha̱maid; 4-PY, 1-methi̱l-4-pai̱ri̱dɔn-5-karböktha̱maid; NR, niköti̱na̱maid raiböth; NMN, nikötinamaid mönöni̱ki̱lötaid. Ɛndhɛmni̱ (mi̱ tɔ̱c): NNMT, nikötinamaid N-methyltranthperɛth; SIRT, ɛ thärtui̱ni̱; NAMPT, nikötinamaid pöthpöri̱böthail tra̱ni̱thperɛth; AOX1, aldɛɣaid ɣɔkthai̱dɛth 1; NRK, nikötinamaid raiböthaid kinathe; NMNAT, nikötinamaid mönö Niukliötaid adenylate tra̱ni̱thperɛth; Pnp1, purin ni̱kli̱öthaid pöthpöri̱lathe. (C) t-SNE duŋ scRNA-thek duŋ athciteth (mi̱ tɔ̱c) kɛnɛ ti̱o̱m (mi̱lual; n = 3 jua̱thni̱). (D) NNMT latdɛ rɛy thëlli̱ puɔ̱pulëcini̱ ti̱ gööl ti̱ ca ŋa̱c kɛ la̱tdɛ kɛɛ scRNA-thek. (E) Nyuɔ̱th NNMT kɛnɛ AOX1 rɛy SK-OV-3, ɛmbriönik kidni̱ ran (HEK) 293T, T thëlli̱ kɛnɛ MNA-treated T thëlli̱. Kä latdɛ min ca mat cua nyoth i̱ thi̱ääkɛ kɛ SK-OV-3. Kä latdɛ pattern kɛ SEM cua nyoth (n = 6 puɔl pua̱a̱ny dönɛri̱). Ct ba̱liö ni̱ ti̱ läny 35 kɛn cua kɛ naŋ i̱ /ca kɛ de jiek (UD). (F) Nyuɔ̱th duŋ SLC22A1 kɛnɛ SLC22A2 rɛy SK-OV-3, HEK293T, T thëlli̱ kɛnɛ T thëlli̱ tin ca riali̱kä kɛ 8mM MNA. Kä latdɛ min ca mat cua nyoth i̱ thi̱ääkɛ kɛ SK-OV-3. Kä latdɛ pattern kɛ SEM cua nyoth (n = 6 dönɛri̱ ti̱ puɔl pua̱nykiɛn). Ct ba̱liö ni̱ ti̱ läny 35 kɛn cua kɛ naŋ i̱ /ca kɛ de jiek (UD). (G) Thëll MNA min te rɛy thëlli̱ tin ca lät kɛ puɔl pua̱a̱ny dönör T kɛ kɔr thaakni̱ ti̱ 72 kä inkubëciɔn kɛ MNA. Kä latdɛ min ca nyoth kɛ SEM cua nyoth (n = 4 dönɛri̱ ti̱ puɔl pua̱nykiɛn).
MNA ɛ mi̱ la nööŋkɛ ɛ naŋdɛ kɛɛ methyl gurup kä S-adenothai̱l-1-methiönain (SAM) ɛ wä kä nikötinamaid (NA) ɛ nikötinamaid N-methyltranthperɛth (NNMT; Thurɛ 3B). NNMT ɛ mi̱ la tuɔɔk ɛlɔ̱ŋ rɛy ka̱nthɛri̱ ran ti̱ gööl kɛnɛ ɣöö jɛn thi̱ääkɛ kɛ pröli̱perɛciɔn, inbɛciɔn kɛnɛ metɛthtathith (25-27). Mi̱ görkɛ ɣöö ba gua̱a̱th in tuɔɔk MNA ŋa̱c ɛ gɔaa rɛy T thëlli̱ rɛy TME, kɔn cua la̱t kɛ scRNA-thek kɛ ciɛŋ tin nyooth NNMT rɛy thëlli̱ ti̱ gööl rɛy aththi̱teth kɛnɛ ti̱o̱muɔri̱ kä HGSC jua̱thni̱ diɔ̱k (Table S5). Anali̱thi̱th duŋ thëlli̱ ti̱ thi̱ääk kɛ 6,500 cuɛ nyoth i̱ rɛy aththi̱teth kɛnɛ tuɔm enba̱rɔnmɛn, NNMT latdɛ cua gaŋ kä min ca thɛm i̱ ɛ pai̱bröbla̱th kɛnɛ tuɔm thëll puɔ̱pulëcini̱ (Pi̱guur 3, C kɛnɛ D). Jɛn gɔaaɛ ɛn ɣöö ba ŋa̱c i̱ thiɛlɛ mi̱ jɔc kä NNMT mi̱ ca nyoth rɛy ɛni̱ puɔ̱pulëcin min nyoth PTPRC (CD45 +) (Pi̱guur 3D kɛnɛ Thurɛ S5A), min nyoth i̱ jɛn MNA min ca jiek rɛy metɛbölai̱te i̱thpekti̱ra̱m cua nööŋ rɛy T thëlli̱. Kä latdɛ duŋ aldeɣaid ɣɔkthai̱dɛth 1 (AOX1) cuɛ MNA ri̱t ɛ la 1-methi̱l-2-pai̱ri̱dɔn-5-karbökthamaid (2-PYR) kiɛ 1-methi̱l-4-pai̱ri̱dɔn-5-karböktha̱maid (4- PYR); Thurɛ 3B) jɛn bä ca gaŋ kä puɔ̱pulëcin duŋ pai̱bröbla̱thni̱ min nyoth COL1A1 (Pi̱guur S5A), min matdiɛn nyoth i̱ T thëlli̱ thiɛlɛ kɛ lua̱ŋ duŋ kɔnbenciɔnal MNA mëtaböli̱dhi̱öm. Kä latdɛ pattern duŋ ji̱i̱ni̱ ti̱ti̱ ti̱ thi̱ääk kɛ MNA cua beri̱pi̱d kɛ la̱tdɛ kɛɛ thɛkɔnd indi̱pɛndɛnt thëll data thɛt mi̱ bä kä HGSC jua̱thni̱ (Pi̱guur S5B; n = 6) (16). Ɛ nyɔk bä, kua̱nti̱tɛtib pöli̱merath cɛɛn riakciɔn (qPCR) anali̱thi̱th duŋ puɔlä pua̱a̱ny dönɔr T thëlli̱ tëë ca riali̱kä kɛ MNA cuɛ nyoth i̱ mi̱ pa̱a̱rkɛ kɛ kɔnti̱röl SK-OV-3 öbariani̱ tuɔm thëlli̱, NNMT kiɛ AOX1 cuɛ thia̱k ɛn ɣöö /ka̱nɛ nyoth (Pi̱guur 3E). Ti̱ti̱ /ka̱n liip i̱ bi̱ ben raar cua nyoth i̱ MNA dɔ̱ŋ bɛ ben raar kä pai̱bröbla̱thni̱ kiɛ ti̱o̱muɔri̱ rɛy T thëlli̱ tin thi̱ääk rɛy TME.
Cieŋni̱ min kandi̱dɛtni̱ cu määni̱ pa̱mɛli̱ duŋ ɣɔrganik kaciɔn tra̱ni̱thpɔrtɛri̱ 1 ɛ wä kä 3 (OCT1, OCT2 kɛnɛ OCT3) enkɔɔd ɛ thɔ̱lubɔl kari̱ɛr 22 (SLC22) pa̱mɛli̱ (SLC22A1, SLC22A2 kɛnɛ SLC22A3), kä buɔ̱m tra̱ni̱thpɔrtɛri̱ duŋ MNA kɛn ŋotkɛ /ka̱nɛ lat (28). QPCR duŋ mRNA mi̱ bä kä puɔl pua̱a̱ny dönör T thëlli̱ cuɛ nyothni̱ lɛbeli̱ ti̱ kuiy nyin SLC22A1 duŋni̱ ɣöö lɛbeli̱ ti̱ /ka̱n jiek kä SLC22A2, min cuɛ nyoth i̱ jɛn cua kɔn lat ni̱ wän rɛy li̱terɛciɛr (Pi̱guur 3F) (29). Mi̱ gua̱c, ɛn SK-OV-3 öbarian tuɔm thëll lany cuɛ nyothni̱ lɛbeli̱ ti̱ di̱t kä tra̱ni̱thpɔrtɛri̱ da̱ŋ rɛw (Pi̱guur 3F).
Rɛy kä ɣöö ba ɣɔ̱n i̱ dɔ̱ŋ de T thëlli̱ tekɛ lua̱ŋ kɛ käp MNA mi̱ dɔ̱ŋ, dönɔr T thëlli̱ tin puɔl pua̱nykiɛn cua kɛ ka̱lciɛr kɛ thaakni̱ ti̱ 72 rɛydɛ ɛn ɣöö tekɛ MNA ti̱ gööl ti̱ ŋuan. Mi̱ thiɛlɛ ɣɛkdhöjeni̱öth MNA, ɛn thëllular kɔntɛnt duŋ MNA /ca de jiek (Pi̱guur 3G). Cieŋni̱ min, T thëlli̱ tin ca lät kɛ ɣɛkdhöjeni̱öth MNA cuɛ nyothni̱ rëp dɔ̱th-diɛn rɛy MNA min te rɛy thëlli̱, ɛ wä kä 6 mM MNA (Pi̱guur 3G). Kä min ci̱ ben raar ɛmɛ cuɛ nyoth i̱ cieŋni̱ min kuiy lɛbel duŋ tra̱ni̱thpɔrtɛr ɣɛkprɛciɔn kɛnɛ thiɛl endhɛm in di̱i̱t min tekɛ luäŋ kɛ kui̱ intrathëllular MNA mëtaböli̱dhi̱öm, TIL ŋotdɛ bɛ MNA naŋ.
Kä i̱thpekti̱ra̱m duŋ metɛbölai̱teth rɛy jua̱thni̱' T thëlli̱ kɛnɛ rɛy bi̱trö MNA abdhɔ̱pciɔn ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ cuɛ rëpni̱ min de rɔ lot kä ka̱nthɛr-aththöciated pai̱bröbla̱thni̱ (CAF) thɛkrɛt MNA kɛnɛ tuɔm thëlli̱ dɔ̱ŋ ba pënötaap kɛnɛ la̱t duŋ TIL riali̱kä. Mi̱ görkɛ ɣöö ba min ci̱ tuɔɔk kä MNA ŋa̱c kä T thëlli̱, puɔl pua̱a̱ny dönör T thëlli̱ cua kɛ la̱t rɛy bi̱trö rɛy gua̱th mi̱ te thi̱n kiɛ thiɛlɛ MNA, kɛnɛ ɣöö cua pröli̱perɛciɔn kɛnɛ thai̱tökain pröda̱kciɔn ɣɔ̱n. Kɛ kɔr ni̱ni̱ da̱ŋ 7 ti̱ ca MNA mat thi̱n kä dɔ̱th in di̱tni̱ jɛn, ɛn nämbär in ci̱ rɔ re̱p kä rɛw cuɛ kuɛ̈ɛ̈ ɛ määth, niɛ gua̱a̱ mɔ cu buɔ̱mdɛ rɔm thi̱n kä dɔ̱thni̱ diaal (Pi̱guur 4A). Ɛ matkɛ nɛmɛ thi̱n, min ca la̱t ɛ ɣɛkdhöjeni̱öth MNA cuɛ nööŋni̱ rëp pröpörciɔn duŋ CD4 + kɛnɛ CD8 + T thëlli̱ ti̱ nyooth tuɔm nekröthi̱th paktɔr-α (TNFα; Thurɛ 4B). Mi̱ gua̱c, ɛn intrathëllular pröda̱kciɔn duŋ IFN-γ cuɛ kuɛ̈ɛ̈ ɛ lɔ̱ŋ rɛy CD4 + T thëlli̱, duŋni̱ ɣöö /cɛ te rɛy CD8 + T thëlli̱, kɛnɛ ɣöö cuɛ thiɛl mi̱ cua ŋa̱c mi̱ ci̱ rɔ gɛr rɛy interli̱ukin 2 (IL-2; Thurɛ 4, C kɛnɛ D). Kɛ kui̱c ɛmɔ, endhɛm-linked immi̱o̱nöthɔrbɛn aththey ​​(ELISA) duŋ thuperna̱tɛnni̱ ti̱ bä kä MNA-treated T thëll ka̱lciɛri̱ ti̱ti̱ cuɛ nyothni̱ rëpdɛ mi̱ di̱i̱t rɛy TNFα, ɛ mi̱ ci̱ wä piny rɛy IFN-γ, kɛnɛ ɣöö cuɛ thiɛl mi̱ ci̱ rɔ gɛr rɛy IL-2 (Pi̱guur 4, E ɛ wä kä G). . Kä min ci̱ IFN-γ wä piny cuɛ nyoth i̱ MNA dɔ̱ŋ bɛ tekɛ luäŋ rɛy ga̱ŋ anti̱-tumɔr ɛkti̱bi̱ti̱ duŋ T thëlli̱. Rɛy kä ɣöö ba min ci̱ tuɔɔk kä MNA thɛm kä T thëll-mediated thai̱tötɔkthi̱ti̱, kaimerik anti̱jen ri̱thɛptɔr T (FRα-CAR-T) thëlli̱ tin targɛtni̱ pölat ri̱thɛptɔr α kɛnɛ CAR-T (GFP) tin ca riali̱kä ɛ gi̱ri̱i̱n pluorethɛn prötien (GFP) -CAR-T) thëlli̱ kɛn la̱tkɛ kɛ puɔl pua̱a̱ny dönör peri̱peral thëll mönönuarPB riɛm (). CAR-T thëlli̱ cua kɛ ka̱lciɛr kɛ thaakni̱ ti̱ 24 rɛy gua̱th ëë te MNA thi̱n, kɛnɛ ɣöö kɛ kɔrɛ cua kɛ kɔ-ka̱lciɛr kɛ yuman SK-OV-3 öbarian tuɔm thëlli̱ cuɛ pölɛt ri̱thɛptɔr α nyoth kä i̱ppɛktɔr ɛ wä kä targɛt rɛci̱ö duŋ 10:1. MNA mëë ca la̱t cuɛ ben raar ɛ la mi̱ ci̱ wä piny ɛ lɔ̱ŋ rɛy läätdä näk FRα-CAR-T thëlli̱, min cu ca̱a̱t kɛ FRα-CAR-T thëlli̱ tëë ca la̱t kɛ adenöthin (Pi̱guur 4H).
(A) Kuën thëlli̱ diaal tin bi̱ lät kɛnɛ puɔ̱pulëcin in ci̱ rɔ re̱p (PD) ɛ wä kä ka̱lciɛr kɛ cäŋkä 7. Kä bar gi̱ra̱p cuŋɛ la mi̱n + SEM duŋ döni̱ da̱ŋ bäkɛl ti̱ puɔl pua̱nykiɛn. Cuŋɛ la data ni̱ ti̱ bä kä n = 3 ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ ti̱ cuŋ kärɔ̱. (B ɛ wä kä D) CD3/CD28 kɛnɛ IL-2 cua kɛ la̱t kɛ lätni̱ T thëlli̱ kä MNA kɔncentrɛciɔni̱kiɛn kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱ kɛ ni̱n 7. Ɛ ŋot /ka̱nɛ ni̱ die̱l guäc, thëlli̱ cua kɛ thɛm kɛ PMA/ai̱önömai̱thi̱n kɛ Gölgi̱thtɔp kɛ thaakni̱ 4. TNFα (B) latdɛ rɛy T thëlli̱. Cäät thurɛ (caam) kɛnɛ tabular data (cuec) duŋ TNFα min ca nyoth rɛy thëlli̱ tin tëk. IFN-γ (C) kɛnɛ IL-2 (D) la kɛn ɛ nyoth rɛy T thëlli̱. Kä latdɛ duŋ thai̱tökini̱ cua thɛm kɛ ja̱l thai̱tömetri̱. Kä bar gi̱ra̱p cuŋɛ la mi̱n (n = 6 nɛy ti̱ puɔl pua̱nykiɛn) + SEM. La̱tdɛ duɔ̱ɔ̱p-kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱ kɛnɛ thëm mi̱ ca nyɔk kɛ lätni̱ (*P<0.05 kɛnɛ **P<0.01) kɛ jiek P ba̱li̱ö. Cuŋɛ la data ni̱ ti̱ bä kä n = 3 ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ ti̱ cuŋ kärɔ̱. (E ɛ wä kä G) CD3/CD28 kɛnɛ IL-2 cua kɛ la̱t kɛ lätni̱ T thëlli̱ kä MNA kɔncentrɛciɔni̱kiɛn kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱ kɛ ni̱n 7. Kä mëdiöm cua ruuli̱ ɛ ŋot kɛnɛ kɛ kɔr thaakni̱ 4 nyin PMA/ai̱önömaithin i̱thtimulaciɔn. Kä kɔncentrɛciɔn duŋ TNFα (E), IFN-γ (F) kɛnɛ IL-2 (G) cua kɛ thɛm ɛ ELISA. Kä bar gi̱ra̱p cuŋɛ la mi̱n (n = 5 nɛy ti̱ puɔl pua̱nykiɛn) + SEM. P ba̱li̱ö cua jiek kɛ la̱tdɛ kɛɛ duɔ̱ɔ̱p-kɛl anali̱thi̱th duŋ ba̱riani̱ kɛnɛ thëm mi̱ ca nyɔk kɛ lätni̱ (*P<0.05). Kä dotted line nyothɛ ni̱ pek in ca jiek kä min ca jiek. (H) Thëll lai̱thi̱th aththei̱. FRα-CAR-T kiɛ GFP-CAR-T thëlli̱ cua kɛ riali̱kä kɛ adenöthin (250μM) kiɛ MNA (10 mM) kɛ thaakni̱ ti̱ 24, kiɛ cua kɛ ba̱ny piny ɛ /ka̱nɛ la̱t (Ctrl). Kä perthäntig näk duŋ SK-OV-3 thëlli̱ cua thɛm. P ba̱li̱ö cua jiek ɛ Wɛlc t thëm (*P<0.5 kɛnɛ **P<0.01).
Rɛy kä ɣöö ba mekani̱thtik ŋa̱c kɛ MNA-diɛn TNFα latdɛ regulɛciɔn, kä min ci̱ rɔ gɛr rɛy TNFα mRNA duŋ MNA-treated T thëlli̱ cua kɛ ɣɔ̱n (Pi̱guur 5A). Dönör T thëlli̱ tin puɔl pua̱nykiɛn tin ca riali̱kä kɛ MNA cukɛ nyothni̱ rëpdɛ ni̱ kä rɛɛw rɛy TNFα tra̱ni̱thkri̱pciɔn lɛbeli̱, cuɛ nyoth i̱ MNA jɛn tëkä TNFα tra̱ni̱thkri̱pciɔnal regulɛciɔn. Mi̱ görkɛ ŋäc kä nɛmɛ min de rɔ lot kä regulatɔri̱ mekani̱dhi̱öm, tra̱ni̱thkri̱pciɔn paktɔri̱ rɛw ti̱ ŋa̱ckɛ tin regulɛt TNFα, ci̱ötkiɛn ɛ la ɛkti̱bɛted T thëll ni̱kli̱e̱e̱r paktɔr (NFAT) kɛnɛ prötien mi̱ ca lɛy 1 (Sp1), cua kɛ diel guec rɛy lucä MNA min matdɛ rɔ kä prödhi̱mal TNFα prömötɛr (30). Kä TNFα prömötɛr tëkɛ 6 ti̱ ca ŋa̱c kä NFAT baindiŋ thaytni̱ kɛnɛ 2 Sp1 baindiŋ thaytni̱, ti̱ ci̱ rɔ̱ mat kä thay kɛl [-55 bɛth rɛwni̱ (bp) ɛ bä kä 5'kap] (30). Krömatin immi̱o̱nöprecipi̱tɛciɔn (ChIP) cuɛ nyoth i̱ mi̱ ca la̱t kɛ MNA, ɛn mat Sp1 ɛ wä kä TNFα prömötɛr cuɛ rɔ re̱p ni̱ kä diɔ̱k. Kä mat NFAT bä cuɛ rɔ rep kä cuɛ thia̱k kɛ min gɔa (Pi̱guur 5B). Data ni̱ ti̱ti̱ cua nyoth i̱ MNA la riali̱dɛ i̱kä kɛ latdɛ duŋ TNFα kɛ rɛy Sp1 tra̱ni̱thkri̱pciɔn, kɛnɛ ɣöö ɛ mi̱ tɔt kä latdɛ duŋ NFAT.
(A) Mi̱ pa̱a̱rkɛ jɛ kɛ T thëlli̱ tin ca ka̱lciɛr ɛ thiɛlɛ MNA, kä min ci̱ rɔ ri̱t kä TNFα latdɛ rɛy T thëlli̱ tin ca tiam kɛ MNA. Kä latdɛ pattern kɛ SEM cua nyoth (n = 5 dönɛri̱ ti̱ puɔl pua̱nykiɛn). Cuŋɛ la data ni̱ ti̱ bä kä n = 3 ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ ti̱ cuŋ kärɔ̱. (B) Kä TNFα prömötɛr duŋ T thëlli̱ cua kɛ riali̱kä kɛ kiɛ thiɛlɛ 8 mM MNA kɛ kɔr NFAT kɛnɛ Sp1 cua kɛ mat kɛɛ (Ctrl) kɛnɛ PMA/ai̱önömaithin i̱thtimulaciɔn kɛ thaakni̱ 4. Immi̱o̱glöbulin G (IgG) kɛnɛ H3 cua kɛ la̱t cie negɛtib kɛnɛ puɔ̱thi̱tib kɔnti̱röli̱ kɛ kui̱ immi̱o̱nöprecipi̱tɛciɔn, kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱. Kä kuanti̱pi̱këcin duŋ Chip cuɛ nyoth i̱ min mat Sp1 kɛnɛ NFAT kä TNFα prömötɛr rɛy MNA-treated thëlli̱ cuɛ rɔ rep ni̱ kä ti̱ ŋuan mi̱ pa̱a̱rkɛ jɛ kɛ kɔnti̱röl. Cuŋɛ la data ni̱ ti̱ bä kä n = 3 ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ ti̱ cuŋ kärɔ̱. P ba̱li̱ö cua jiek ɛ t-thɛmni̱ ti̱ ŋuan (*** P <0.01). (C) Mi̱ pa̱a̱rkɛ jɛ kɛ aththi̱teth duŋ HGSC, T thëlli̱ (nɔ̱n-thai̱tötökthik) cuɛ nyothni̱ rëp latdä TNF rɛy ti̱o̱mä. Kä biɛɛl cuŋkɛ ɛ la jua̱th ti̱ gööl. Kä thëlli̱ tëë ca nyoth cua kɛ randɔmi̱li̱ tha̱mpuɔl ɛ wä kä 300 kɛnɛ ɣöö cua kɛ jitter kɛ pek mi̱ ca thur ɛlɔ̱ŋ (** Padj = 0.0076). (D) Mödɛl mi̱ ca nööŋ nhial duŋ MNA kɛ kui̱ ka̱nthɛrä öbarian. MNA laa jɛ laa no̱o̱ŋɛ rɛy thëlli̱ ti̱muɔr kɛnɛ pai̱brɔbla̱thni̱ rɛy TME kä laa jɛ laa naŋkɛ ɛ T thëlli̱. MNA cuɛ rëpni̱ matdɛ kɛɛ Sp1 ɛ wä kä TNFα prömötɛr, bɛ cu nööŋni̱ rëp TNFα tra̱ni̱thkri̱pciɔn kɛnɛ TNFα thai̱tökain pröda̱kciɔn. MNA bä la no̱o̱ŋɛ kuɛ̈ɛ̈ rɛy IFN-γ. Ini̱bi̱ciɔn duŋ T thëll pa̱ŋciɔn la no̱o̱ŋɛ ni̱ ɣöö bi̱ lua̱ŋ näkdɛ kuɛ̈ɛ̈ kɛnɛ ɣöö bɛ tuɔm jakä piith kɛ pɛ̈th.
Kɛ mëë ca lar ɛ lääri̱, TNFα tëkɛ nhiam kɛnɛ jɔk-mi̱ tekä anti̱-tumɔr kɛnɛ anti̱-tumɔr i̱pɛ̈ktni̱, duŋni̱ ɣöö jɛn tëkɛ luäŋ mi̱ ŋa̱ckɛ-ɛlɔ̱ŋ rɛy kä ɣöö bɛ piith kɛnɛ metɛthtathith duŋ ka̱nthɛr öbariani̱ (31-33). Kä min ca lar ɛ lääri̱, ɛn kɔni̱thɛntraciɔn duŋ TNFα rɛy aththi̱teth kɛnɛ tuɔm ti̱cuthni̱ rɛy nɛɛni̱ tin tekɛ ka̱nthɛr öbarian ɛ mi̱ di̱i̱t mi̱ läny min te rɛy benign ti̱cuthni̱ (34-36). Rɛy ri̱e̱e̱tni̱ mekani̱dhi̱öm, TNFα bɛ lät, la̱tdɛ kɛnɛ rëp thëlli̱ riɛm tin bo̱o̱r riali̱kä, kɛnɛ ɣöö bɛ pënötaap duŋ thëlli̱ ka̱nthɛrä gɛr (37, 38). Ɛ wä kɛɛl kɛ ti̱ti̱ tëë ca jiek, di̱fferencial ji̱i̱n ɣɛkprɛciɔn anali̱thi̱th cuɛ nyoth i̱ TNF cuɛ tekɛ luɔt mi̱ di̱i̱t mi̱ ca rep-rɛgulɛted rɛy T thëlli̱ rɛy tumä ti̱cuthni̱ mi̱ pa̱a̱rkɛ jɛ kɛ aththi̱teth (Pi̱guur 5C). Kä rëp TNF ëë ca nyoth cuɛ jɔɔc kärɔa rɛy T thëll puɔ̱pulëcini̱ kɛ nɔ̱n-thai̱tötökthik pënötaap (Pi̱guur S5A). Rɛy ŋaknɔmädɛ, kɛn data ni̱ ti̱ti̱ luäk kɛn guäc i̱ MNA tëkɛ dual immi̱o̱nöthɔ̱ppreththib kɛnɛ ti̱o̱m prömötiŋ i̱pɛktni̱ rɛy HGSC.
Pluorethɛn lɛbeliŋ min lät kä plöw thaytömetri̱ cuɛ ben ɛ la ca̱p in di̱tni̱ jɛn kɛ kui̱ ŋi̱i̱cä TIL mëtaböli̱dhi̱öm. Ŋi̱i̱cni̱ ti̱ti̱ cua nyoth i̱ mi̱ pa̱a̱rkɛ kɛ peri̱peral riɛm li̱mphöthai̱teth kiɛ T thëlli̱ tin bä kä thɛkɔnderi̱ li̱mphöid ɣɔrgani̱, murine kɛnɛ raan TIL tekɛ luäŋ mi̱ di̱i̱t mi̱ naŋkɛ glukööth (4, 39) kɛnɛ ɣöö bɛ cu bath ɛ määth kä mai̱tökɔndi̱rial pa̱ŋciɔn (19, 40). Cieŋni̱ min ci̱ kɔnɛ guic i̱ cäätdɛ rɛy ŋi̱i̱cä ɛmɛ, min di̱tni̱ jɛn kä ben nhial ɛ pääri̱ metɛböli̱dhi̱öm duŋ tumä thëlli̱ kɛnɛ TIL min bä kä tumä ti̱cuth mi̱ ca woc mi̱ cäät. Ɛ wä kɛɛl kɛ tha̱a̱ŋ lääri̱ ti̱ti̱ tëë nhiam, ti̱o̱m (CD45-EpCAM +) thëlli̱ ti̱ bä kä aththi̱teth kɛnɛ ti̱o̱mni̱ tekɛ glukööth mi̱ di̱i̱t mi̱ naŋkɛ ɛ läny CD8 + kɛnɛ CD4 + T thëlli̱, luäkɛ jɛ ɛn ɣöö glukööth mi̱ di̱i̱t mi̱ naŋkɛ kä ti̱o̱m thëlli̱ dɔ̱ŋ ba pa̱a̱r kɛ T thëlli̱. Kä ŋäc duŋ T thëll kɔmpi̱tɛciɔn. TME. Cieŋni̱ min, ɛn la̱t mai̱tökɔndi̱rial duŋ tumä thëlli̱ di̱tdɛ ɛlɔ̱ŋ mi̱ läny min tekä CD8 + T thëlli̱, duŋni̱ ɣöö ɛn lät mai̱tökɔndi̱rial cäätdɛ kɛ min tekä CD4 + T thëlli̱. Ti̱ti̱ ci̱ ben raar cua thi̱i̱m ëë ci̱ ben raar jakä bum min la ɣɔkdhi̱dɛtib mëtaböli̱dhi̱öm ɛ mi̱ gɔa kɛ kui̱ thëlli̱ ti̱o̱mä (41, 42). Kɛn bä cu kɛnɛ lar ɛn ɣöö CD8+T thëlli̱ dɔ̱ŋ bi̱ kɛn ɣɔkdhi̱dɛtip di̱thpa̱ŋciɔn jakä thia̱k ɛlɔ̱ŋ mi̱ läny CD4+T thëlli̱, kiɛ ɛn CD4+T thëlli̱ dɔ̱ŋ bi̱ kɛn lät kɛ karbön mi̱ dɔ̱ŋ mi̱ läny glukööth kɛ rɔmdɛ lät mai̱tökɔndi̱rial thi̱n (43, 44). Jɛn ba ŋa̱c i̱ /thiɛlɛ dääk mi̱ ca guic rɛy glukööth min naŋkɛ kiɛ lät mai̱tökɔndi̱rial kam CD4 + T i̱ppɛktɔri̱, T i̱ppɛktɔri̱ mɛmöri̱ kɛnɛ T thäntral mɛmöri̱ thëlli̱ rɛy aththi̱teth. Päärkɛ, ɛn dääk wec CD8 + T thëlli̱ rɛy ti̱o̱muɔri̱ thiɛlɛ mi̱ lätdɛ kɛɛ gër rɛy glukööth min naŋkɛ, nyothɛ dääk in di̱i̱t kam T thëlli̱ tin ca ka̱lciɛr rɛy bi̱trö kɛnɛ yuman TIL rɛy bi̱bö (22). Guäc ti̱ti̱ cua kɛ kɔnpääm bä kɛ la̱tdɛ kɛɛ ɣa̱nbai̱ath autömatik thëll puɔ̱pulëcin allokɛciɔn, min cuɛ räth ni̱ kä ɣöö cuɛ nyoth i̱ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + thëlli̱ kɛ glukööth mi̱ di̱i̱t mi̱ naŋkɛ kɛnɛ mai̱tökɔndi̱rial ɛkti̱bi̱ti̱ mi̱ läny tuɔm thëlli̱ kɛn cukɛ te thi̱n duŋni̱ ɣöö tekɛ Metabolik ɣɛktib thëll puɔ̱pulëcin. Puɔ̱pulëcin ɛmɛ dɔ̱ŋ bɛ cuɔ̱ŋ ɛ la putatip tha̱bpöpulëcin duŋ mai̱löid thuppreththɔr thëlli̱ kiɛ pla̱thma̱thi̱töid dendritik thëlli̱ tin ca ŋic rɛy scRNA-thek anali̱thi̱th. Cieŋni̱ min kɛn da̱ŋ rɛw ti̱ti̱ cua kɛ lat rɛy öbarian ti̱muɔri̱ ran [45], kɛn ŋotkɛ go̱o̱r kɛn la̱t mi̱ dɔ̱ŋ ɛ ɣöö ba mai̱löid tha̱bpöpulëcin ɛmɛ lat.
Cieŋni̱ min ja̱l thaytömetri̱-bɛth methɔdni̱ bɛ dääk in di̱i̱t rɛy glukööth kɛnɛ ɣɔkdhi̱dɛtip mëtaböli̱dhi̱öm kam thëlli̱, ɛn mëtabölai̱teth in thuɔ̱k min nööŋkɛ ɛ glukööth kiɛ gua̱th karbön kɔ̱kiɛn kɛ kui̱ mai̱tökɔndi̱rial mëtöböli̱dhi̱öm rɛy TME /ka̱nɛ ni̱ ŋa̱c. Mi̱ caa metɛbölai̱teth la̱th thi̱n kiɛ thiɛlɛ jɛ kä TIL thɔ̱bthet in caa ŋun go̱o̱rɛ ɣöö baa thëll puɔ̱pulëcin jakä gɔaa kä ti̱cuth in caa woc. Kɛ kui̱c ɛmɔ, thëll enri̱ci̱mɛn methɔd dan matdɛ kɛɛ ma̱th i̱thpekti̱römeti̱ri̱ bɛ cu nööŋni̱ ŋäc rɛy metɛbölai̱teth tin tekɛ dääk mi̱ ci̱ ri̱w rɛy T thëlli̱ kɛnɛ tuɔm thëll puɔ̱pulëcini̱ rɛy matdä tha̱mpuɔli̱ jua̱thni̱. Cieŋni̱ min ca̱p ɛmɛ tëkɛ ti̱ gɔw ti̱ läny pluorethcen-ɛkti̱bɛted thëll thɔ̱rtiŋ, tha̱a̱ŋ metɛbölai̱te librari̱ dɔ̱ŋ ba kɛ ya̱r kɛ kui̱ inɣɛrent i̱thta̱bi̱e̱li̱ti̱ kɛnɛ/kiɛ rɛp turnöber rɛt (22). Cieŋni̱ min, ca̱pda cuɛ luäŋ kɛ ŋi̱e̱c rɛw ti̱ ca ŋic i̱mmi̱o̱nöthɔ̱ppreththib metɛbölai̱teth, adenöthin kɛnɛ kai̱nurenain, kɛ ɣöö kɛn tekɛ dääk mi̱ di̱i̱t kam tha̱mpuɔli̱.
Metabonömik anali̱thi̱th ëë la̱t kɛ kui̱ ti̱o̱muɔri̱ kɛnɛ TIL tha̱btaapni̱ cuɛ ŋuni̱ ŋäc mi̱ di̱i̱t rɛy la̱t metɛbölai̱teth rɛy öbarian TME. Kɛ nhiam, kɛ la̱tdɛ kɛɛ plöw thai̱tömetri̱, cua jiek ɛn ɣöö cuɛ thiɛl dääk rɛy läätdä mai̱tökɔndi̱rial kam ti̱o̱muɔri̱ kɛnɛ CD4 + T thëlli̱. Cieŋni̱ min, LC-MS/MS anali̱thi̱th cuɛ nyoth i̱ tekɛ mi̱ ci̱ rɔ gɛr rɛy ŋuan metɛbölai̱teth rɛy puɔ̱pulëcini̱ ti̱ti̱, cuɛ nyoth i̱ guutdɛ kɛ kui̱ TIL metɛböli̱dhi̱öm kɛnɛ lät metɛbölikni̱kɛ diaal go̱o̱rɛ ɣöö ba luɔcdiɛn ŋa̱c ɛ gɔaa. Rɛwdɛ, MNA ɛ jɛn metɛbölai̱te min tekɛ dääk mi̱ di̱i̱t kam CD45-thëlli̱ kɛnɛ T thëlli̱ rɛy aththi̱teth, /ciɛɛ ti̱muɔri̱. Kɛ kui̱c ɛmɔ, kɔmpa̱rti̱mɛntali̱dhëcin kɛnɛ gua̱a̱th in te tuɔm thi̱n dɔ̱ŋ bɛ tekɛ ti̱ gööl ti̱ bɛ nööŋ kä TIL mëtaböli̱dhi̱öm, min nyoth ɣe̱ti̱röjeni̱ti̱ min de rɔ lot rɛy mai̱kröenba̱rɔnmɛn min ca ŋun. Min diɔ̱kdiɛn, ɛn latdɛ duŋ MNA-pröda̱kciɔn endhɛm NNMT jɛn di̱tdɛ ɛlɔ̱ŋ kä CAF, min la tuɔm thëlli̱ ɛ wä kä pek mi̱ tɔt, duŋni̱ ɣöö lɛbeli̱ MNA tin ca jiek kɛn cua kɛ guic rɛy tuɔm-deri̱bed T thëlli̱. Kä öberɛkpreciɔn duŋ NNMT rɛy öbarian CAF tëkɛ mi̱ ŋa̱ckɛ i̱ ka̱nthɛr-prömötiŋ ëpɛkt, tha̱a̱ŋdɛ cuɛ nööŋni̱ ɣöö cuɛ CAF mëtaböli̱dhi̱öm jakä wä nhial, tuɔm inbaciɔn kɛnɛ metɛthtathi̱th (27). Cieŋni̱ min ɛn lɛbel kɛɛliw duŋ TIL ɛ mi̱ tɔt, ɛn latdɛ duŋ NNMT rɛy CAF ɛ mi̱ thi̱ääk kɛ Kanthɛr Jenɔm Atla̱th (TCGA) methencaimal tha̱btaap, min thi̱ääk kɛ prögni̱thi̱th mi̱ jiääk (27, 46, 47). Kɛ jɔakdɛ, ɛn latdɛ ɛn endhɛm AOX1 min tekɛ luäŋ kɛ wuɔ̱c MNA jɛn bä cuɛ tekɛ guut kä CAF puɔ̱pulëcin, min nyoth ɣöö T thëlli̱ thiɛlɛ kɛ lua̱ŋ mi̱ de MNA gɛr. Ti̱ti̱ ci̱ ben raar luäk kɛn ca̱r min cieŋni̱ min go̱o̱r la̱t mi̱ dɔ̱ŋ kɛ ŋäc kä min ca jiek ɛmɛ, lɛbeli̱ ti̱ di̱t nyin MNA rɛy T thëlli̱ dɔ̱ŋ bɛ nyoth i̱ tekɛ immi̱o̱nöthɔ̱ppreththib CAF mai̱kröenba̱rɔnmɛn thi̱n.
Kɛ min ca ŋun ɛ la lɛbel in kuiy kä MNA tra̱ni̱thpɔrtɛri̱ kɛnɛ lɛbeli̱ tin /ca de luäŋ kɛ jiek kä prötieni̱ tin di̱t tin te rɛy MNA mëtaböli̱dhi̱öm, ɛn ta̱a̱ MNA rɛy T thëlli̱ ɛ mi̱ /ca liip. Niɛ NNMT kiɛ AOX1 /ka̱nɛ luäŋ kɛ jiek ɛ scRNA-thek anali̱thi̱th kɛnɛ targɛt qPCR duŋ kɔɣɔrti̱ni̱ rɛw ti̱ cuŋ kärɔ̱. Ti̱ti̱ ci̱ ben raar cua nyoth i̱ MNA /cɛ thänthei̱dhaid ɛ T thëlli̱, duŋni̱ ɣöö cua naŋ kä TME in caa göl piny. Rɛy bi̱trö ɣɛkpi̱ri̱mɛni̱ cuɛ nyoth i̱ T thëlli̱ la kɛn ɣɛkdhöjeni̱öth MNA ɛ ruuli̱.
Ŋi̱i̱cni̱ kɔn rɛy bi̱trö cua nyoth i̱ ɣɛkdhöjeni̱öth MNA cuɛ nööŋni̱ latdɛ duŋ TNFα rɛy T thëlli̱ kɛnɛ ɣöö cuɛ rëp matdä duŋ Sp1 ɛ wä kä TNFα prömötɛr. Cieŋni̱ min TNFα tëkɛ lät anti̱-tumɔr kɛnɛ anti̱-tumɔr, rɛy ka̱nthɛrä öbarian, TNFα bɛ cu jakä pieth ka̱nthɛr öbarian (31-33). Kä neutrali̱dhëcin duŋ TNFα rɛy öbarian ti̱o̱m thëll ka̱lciɛr kiɛ wuɔ̱c TNFα thi̱knal rɛy mödɛli̱ muɔth bɛ TNFα-mediated inpla̱mɛtɔri̱ thai̱tökain pröda̱kciɔn jakä gɔa kɛnɛ ɣöö bɛ pieth ti̱o̱mä gaŋ (32, 35). Kɛ kui̱c ɛmɔ, rɛy kä nɛmɛ, TME-in jiɛn kä MNA bɛ lät cie prö-inpla̱mɛtɔri̱ metɛbölai̱te kɛ rɛy TNFα-dipɛndɛnt mekani̱dhi̱öm kɛ rɛy ötɔkrain lup, kɛ kui̱c ɛmɔ bɛ cu nööŋni̱ ɣöö bɛ cu tuɔɔk kɛnɛ däkdɛ piny kä ka̱nthɛr öbariani̱ (31). Kɛ min de rɔ lot, TNFα blɔkɛd cua ŋi̱e̱e̱c cie mi̱ ɛ therapeutik ɛjɛnt mi̱ bum kɛ kui̱ ka̱nthɛrä öbarian (37, 48, 49). Ɛ nyɔk bä, MNA la ya̱rɛ thai̱tötökthi̱ti̱ duŋ CAR-T thëlli̱ ɛ wä kä öbariani̱ tuɔm thëlli̱, kɛ ŋundɛ kɛɛ cäätdɛ mi̱ dɔ̱ŋ kɛ kui̱ MNA-mediated immi̱o̱n thuppreciɔn. Kɛ matdiɛn kɛɛl, kɛn tin ci̱ ben raar cu kɛnɛ lar i̱ ɛ mödɛl min bi̱ ti̱muɔri̱ kɛnɛ CAF thëlli̱ MNA woc rɛy ɣɛktrathëllular TME. Kɛ rɛy (i) TNF-indɔktid öbarian ka̱nthɛr pi̱e̱th i̱thtimulaciɔn kɛnɛ (ii) MNA-indɔktid T thëll thai̱tötökthik ɛkti̱bi̱ti̱ ini̱bi̱ciɔn, nɛmɛ dɔ̱ŋ bɛ tekɛ dual tuɔm i̱pɛkt (Pi̱guur 5D).
Rɛy thukädɛ, kɛ läthdɛ lät kɛ mat thëll mi̱ pɛ̈th mi̱ ci̱ rɔ rep, thi̱ŋgil-thëll thi̱kuɛnthiŋ kɛnɛ metɛbölik pröpai̱liŋ, ŋi̱i̱c ɛmɛ cuɛ nyothni̱ dääk mi̱ di̱i̱t kä immi̱o̱nömetabölömik kam ti̱o̱muɔri̱ kɛnɛ aththi̱teth thëlli̱ rɛy HGSC jua̱thni̱. Ɛn anali̱thi̱th ɛmɛ kɛɛliw cuɛ nyoth i̱ tëkɛ dääk rɛy glukööth min naŋkɛ kɛnɛ lät mai̱tökɔndi̱rial kam T thëlli̱, kɛnɛ ɣöö cuɛ MNA ŋic cie nɔ̱n-thëll autönömuɔ̱th immi̱o̱n regulɛtɔri̱ metɛbölai̱te. Data ni̱ ti̱ti̱ tekɛ mi̱ ci̱ rɔ gɛr kä TME bɛ T thëll mëtaböli̱dhi̱öm ya̱r i̱di rɛy ka̱nthɛri̱ ran. Cieŋni̱ min kööŋ in jɔc kɛ kui̱ nutriɛn kam T thëlli̱ kɛnɛ ka̱nthɛr thëlli̱ cua lat, metɛbölai̱teth bä lätdɛ cie mi̱ ɛ regulɛtɔri̱ ti̱ jɔc kɛ rëp ti̱o̱mä kɛ rëpdɛ kɛnɛ ɣöö dɔ̱ŋ bɛ endöjeni̱öth immi̱o̱n ri̱thpɔnthni̱ gaŋ. Kä latdɛ min dɔ̱ŋ kɛ kui̱ läätdä regulɛtɔri̱ metɛbölai̱tethni̱ ti̱ti̱ dɔ̱ŋ bɛ ca̱p mi̱ dɔ̱ŋ lɛp kɛ rëp anti̱-tumɔr immi̱o̱n ri̱thpɔn.
I̱thpethi̱mɛni̱ jua̱thni̱ kɛnɛ data ni̱ ki̱li̱nikni̱ cua kɛ jiek kɛ rɛy BC ka̱nthɛr ti̱o̱m ti̱cuth repo̱thi̱töri̱ mi̱ ca thärti̱pi̱d ɛ Kanadian Ticiu Repo̱thi̱töri̱ Netwɔk. Kɛ mëë ca lar ɛ prötokɔ̱l ëë ca nhɔk ɛ BC Kanthɛr Rithääc Ethikni̱ Kɔmiti̱ kɛnɛ Yuni̱berthi̱ti̱ duŋ Bri̱ti̱c Kɔlömbia (H07-00463), i̱thpethi̱mɛni̱ jua̱thni̱ diaal kɛnɛ data ni̱ ki̱li̱nikni̱ cua kɛ jiek kɛ latdɛ mi̱ ca gɔ̱r piny mi̱ ca nhɔk kiɛ cua nhökdiɛn lo̱k kɛ duɔ̱ɔ̱p mi̱ ŋa̱ckɛ. Kä tha̱mpuɔli̱ kɛn cua kɛ tɔ̱w rɛy BaöBank mi̱ ca thärti̱pi̱d (BRC-00290). Ciaŋ jua̱thni̱ diaal cua kɛ nyoth rɛy Tɛbɛli̱ S1 kɛnɛ S5. Kɛ kui̱ krayöprɛthärbɛciɔn, ɛn i̱thkalpel ɛ mi̱ la̱tkɛ kɛ makanɛli̱ kɛ wuɔ̱c tha̱mpuɔlä tumä jua̱thni̱ kɛnɛ ɣöö kɛ kɔrɛ ba cu yuɔr rɛy 100-mai̱krɔn pi̱li̱tɛr kɛ jiek thëll kɛl mi̱ ca tha̱thpɛnciɔn. Kä aththi̱teth duŋ jua̱th cua thɛnti̱ri̱puɔɔd kä 1500 rpm kɛ minitni̱ 10 kä 4°C kɛ pellet thëlli̱ kɛnɛ ɣöö ba thuperna̱tɛn woc. Thëlli̱ tëë ca jiek kä ti̱o̱m kɛnɛ aththi̱teth cua kɛ krayöprethärbɛd rɛy 50% lëth-inakti̱bɛted yuman AB thi̱ra̱m (Thi̱gma-Aldri̱k), 40% RPMI-1640 (Thermö Pi̱ther Thaanytipik) kɛnɛ 10% dai̱methi̱l tha̱lpökthai̱d. Ti̱ti̱ cua kɛ tɔ̱w kɛ thi̱ŋgil thëll tha̱thpɛnciɔn cua kɛ jakä jiɛn kɛnɛ ɣöö cua kɛ la̱t kɛ kui̱ metɛbölömikni̱ kɛnɛ metɛbölai̱te determinɛciɔn min ca lat piny.
Kä mëdiöm mi̱ ci̱ thuɔ̱k tëkɛ 0.22 μm mi̱ ca pi̱li̱tɛr 50:50 mi̱ ca mat thi̱n ɛ RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermö Pi̱ther Thaanytipik) cua mat kɛɛ 10% lëth-inakti̱bɛted raan AB thi̱ra̱m (Thi̱gma-Aldri̱k), 12.5 mM Ɣepeth (Thermö Pi̱ther Thaanytipik), 2 mM l-glutamine (Therpik Pi̱ther Thaanytipik), 2 mM l-glutamine (Therpik Pi̱ther Thaanytipik), I̱thtreptömaithin (PenI̱thti̱rep) thɔ̱luciɔn (Thermö Pi̱ther Thaanytipik) kɛnɛ 50 μMB-merkaptöethanöl. AimV (Inbi̱tröjen) ɛ mi̱ ca mat kɛɛ 20 mM Ɣepeth (Thermö Pi̱ther Thaanytipik) kɛnɛ 2 mM l-glutamine (Thermö Pi̱ther Thaanytipik). Kä ja̱l thai̱tömi̱ti̱r i̱thtɛniŋ bupper cuɛ tekɛ 0.22μm pi̱li̱tɛr pöthpët buppered thalain (PBS; Inbi̱tröji̱n) cua mat kɛɛ 3% lëth-inakti̱bɛted AB yuman thi̱ra̱m (Thi̱gma). Kä thëll enri̱ci̱mɛn bupper ɛ mi̱ ca mat kɛɛ 0.22μm mi̱ ca pi̱li̱tɛr PBS kɛnɛ ɣöö cua mat kɛɛ 0.5% ɣi̱th-inakti̱bɛted yuman AB thi̱ra̱m (Thi̱gma-Aldri̱k).
Rɛy 37°C mi̱diöm mi̱ ci̱ thuɔ̱k, thëlli̱ cua kɛ biɛl kɛ 10 nM MT DR kɛnɛ 100 μM 2-NBDG kɛ minitni̱ ti̱ 30. Kɛ kɔrɛ, kɛn thëlli̱ cua kɛ biɛl kɛ bai̱bili̱ti̱ dai̱ eF506 kä 4°C kɛ minitni̱ 15. Ri̱thɔ̱thpɛnd thëlli̱ rɛy FC Blɔk (eBaöthaany) kɛnɛ Brilliant I̱thtɛn Bupper (BD Baöthaany), di̱luciɔn rɛy plöw thai̱tömi̱ti̱r i̱thtɛniŋ bupper (kɛ mëë ca la̱r ɛ ram min lätdɛ), kɛnɛ inkubɛciɔn kɛ minitni̱ 10 kä lëth duëël. I̱thtɛniŋ thëlli̱ kɛ thɛt duŋ ani̱buɔdi̱ni̱ (Table S2) rɛy plöw thai̱tömetri̱ i̱thtɛniŋ bupper kä 4°C kɛ minitni̱ ti̱ 20. Reththpɛnd thëlli̱ rɛy plöw thai̱tömetri̱ i̱thtɛniŋ bupper (Thaitek Auröra; 3L-16V-14B-8R kɔni̱gi̱ra̱pɛciɔn) ɛ ŋot anali̱thi̱th. La̱tdɛ I̱thpekti̱röPlö kɛnɛ PlöwJö V10 kɛ anali̱thi̱th thëll kuën data ni̱, kɛnɛ ɣöö lätdɛ Gi̱ra̱pPad Pri̱dhi̱m 8 kɛ ca̱k data ni̱. Kä median pluorethcen intenthi̱ti̱ (MFI) duŋ 2-NBDG kɛnɛ MT DR cua lög-nɔrmali̱dhed, kɛ kɔrɛ cua t thëm rɛwdɛ la̱t kɛ kui̱ i̱thtathti̱thtikal anali̱thi̱th kɛ kuën jua̱thni̱ tin ci̱ ca̱a̱t. Kämni puɔ̱pulëcini̱ diaal tin kuiyni̱ kɛn kä 40 ti̱ ci̱ tuɔɔk kä anali̱thi̱th; la̱thni MFI ba̱li̱ö duŋ 1 kɛ kui̱ ɛni̱ negɛtib ba̱li̱ö ɛ ŋot kän i̱thtathti̱thtikal anali̱thi̱th kɛnɛ data bithuali̱dhëcin la̱t.
Rɛy kä ɣöö ba manual gating i̱thtrateji̱ min te nhial kä prötheth panɛl mat thi̱n, kɔnɛ cua la̱t kɛ annötɛciɔn kɛɛliw ɛ thurɛ min gaŋ jiath (FAUST) (21) kɛ la̱th thëlli̱ kä puɔ̱pulëcin kärɔa kɛ kɔr kä mëë ca thëlli̱ tin ci̱ li̱w woc rɛy PlöwJo. Kɔn la̱tnɛ min bä raar kɛ tet kɛ mat puɔ̱pulëcini̱ tin ce̱tkɛ mi̱ ca kɛ da̱a̱k ɛ jiäk (mat PD1+ kɛ PD1-tumɔr thëlli̱) kɛnɛ puɔ̱pulëcini̱ tin ca rɔm thi̱n. Tha̱mpuɔl kɛl tëkɛ aberig mi̱ läny 2% thëlli̱, kɛ mat puɔ̱pulëcini̱ 11.
Pikɔl gi̱rɛdiɛn denthi̱ti̱ thɛnti̱ri̱pugɛcin cua la̱t kɛ dääk PBMC kä leuköthai̱te thɛparɛciɔn pröda̱kni̱ (I̱THTEMCELL Tekinölöji̱thni̱). CD8 + T thëlli̱ cua kɛ woc kä PBMC kɛ la̱tdɛ kɛɛ CD8 Mai̱kröBeadni̱ (Miltenyi) kɛnɛ ɣöö cua kɛ re̱p rɛy mëdiöm mi̱ ci̱ thuɔ̱k kɛ la̱tdɛ kɛɛ Tra̱ni̱thAkt (Miltenyi) kɛ juɔkni̱ 2 kɛ mëë ca la̱r ɛ ram ëë lätdɛ. Kä thëlli̱ cua kɛ jakä cuɔ̱ŋ kɛ ni̱n 5 rɛy mëdiöm mi̱ ci̱ thuɔ̱k min te IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), kɛ kɔrɛ cua kɛ nyɔk kɛ thëm kɛ Tra̱ni̱thAkt. Kɛ cäŋ kä 7, kɛ mëë ca la̱r ɛ ram ëë lätdɛ, cua CD45 MicroBeads (Miltenyi) ran la̱t kɛ rëp thëlli̱ rɛy ro̱undni̱ diɔ̱k ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱. Kä thëlli̱ cua kɛ ali̱kɔt kɛ kui̱ ja̱l thai̱tömetri̱ anali̱thi̱th (cie min ca lat nhial), kɛnɛ thëlli̱ mi̱lli̱ön kɛl cua kɛ ali̱kɔt ni̱ kä diɔ̱k kɛ kui̱ LC-MS/MS anali̱thi̱th. Kä tha̱mpuɔli̱ cua kɛ la̱t ɛ LC-MS/MS cie min ca lat piny. Cu nɛy ɛ thɛm ɛn ba̱li̱ö metɛbölai̱te min ci̱ bath kɛ ai̱ön nämbär mi̱ 1,000. Tha̱mpuɔl kɛl ɛ mi̱ ca jakä wä kɛɛl ɛ mat ai̱ön nämbär (TIC), lɔga̱ri̱thi̱mi̱kalli̱ min ca riali̱kä kɛnɛ ɣöö bɛ rɔ lot kärɔa rɛy MetaboAnali̱thi̱thR ɛ ŋot anali̱thi̱th.
Kä thi̱ŋgil thëll tha̱thpɛnciɔn duŋ jua̱th kɛl cua nyɔk kɛ lëth kɛnɛ ɣöö cua pi̱li̱tɛr kɛ rɛy 40 μm pi̱li̱tɛr rɛy mëdiöm mi̱ ci̱ thuɔ̱k (cie min ca lat nhial). Kɛ mëë ca lar ɛ prötokɔ̱l duŋ manupakciɛr, ro̱undni̱ diɔ̱k ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱ kä puɔ̱thi̱tib thɛlɛkciɔn ɛ magnɛtik bead thɛparɛciɔn kɛ la̱tdɛ kɛɛ Mai̱kröBi̱i̱dni̱ (Miltenyi) cua kɛ la̱t kɛ jak tha̱mpuɔli̱ kä ri̱i̱ŋ kɛ kui̱ CD8+, CD4+ kɛnɛ CD45- thëlli̱ (kä ɣaci̱). Kɛ ciɛk, kɛn thëlli̱ kɛn cua kɛ nyɔk kɛ thɔ̱thpɛndiŋ rɛy thëll enri̱cimɛn bupper (cie min ca lat nhial) kɛnɛ ɣöö ba kɛ kuɛn. Kä thëlli̱ cua kɛ inkubɛted kɛ yuman CD8 bi̱i̱dni̱, yuman CD4 bi̱i̱dni̱ kiɛ yuman CD45 bi̱i̱dni̱ (Miltenyi) kä 4°C kɛ minitni̱ 15, kɛ kɔrɛ cua kɛ lak kɛ thëll enri̱cimɛn bupper. Kä tha̱mpuɔl cua wä rɛy LS kɔlöm (Miltenyi), kɛnɛ ɣöö cua puɔ̱thi̱tip kɛnɛ negɛtib pi̱rɛkcini̱ ruuli̱. Rɛy kä ɣöö ba gua̱a̱thdɛ jakä kuiy kɛnɛ rëp ka̱th in bi̱ thëll rɔ luɔc thi̱n, ɛn CD8-pi̱rɛkcin kɛ kɔrɛ ba cu la̱t kɛ ro̱und in rɛwdɛ duŋ CD4+ enri̱cimɛn, kɛnɛ ɣöö ɛn CD4-pi̱rɛkcin ba cu la̱t kɛ kɔrɛ CD45-enri̱cimɛn. Käp thɔ̱luciɔn wi̱i̱ ɣacä rɛy la̱t dääkädiɛn kɛɛliw.
Mi̱ görkɛ riali̱ tha̱mpuɔli̱ i̱kä kɛ kui̱ metɛbölai̱te anali̱thi̱th, kɛn thëlli̱ cua kɛ lak kä kɛɛl kɛ ɣaci̱-kɔld tha̱lt thuluciɔn, kɛnɛ ɣöö cua 1 ml duŋ 80% methanöl mat kä tha̱mpuɔl kɛl, kɛ kɔrɛ cua kɛ wortɛk kɛnɛ ɣöö cua kɛ jakä kɔ̱c rɛy li̱kuid nai̱tröji̱n. Kä tha̱mpuɔli̱ cua kɛ la̱th rɛy thärkäli̱ diɔ̱k ti̱ kɔ̱c-thaw kɛnɛ ɣöö cua kɛ thɛnti̱ri̱puɔɔd kä 14,000 rpm kɛ minitni̱ 15 kä 4°C. Kä thuperna̱tɛn min tekɛ metɛbölai̱teth bɛ cu kööt amääni̱ mi̱ cɛ kööt. Kä metɛbölai̱teth cua kɛ nyɔk kɛ li̱ööm rɛy 50 μl duŋ 0.03% puɔrmik athi̱d, cua kɛ wortɛk kɛ li̱ɔɔm, kɛ kɔrɛ cua kɛ thɛnti̱ri̱puɔɔd kɛ wuɔ̱c kä tin ci̱ duɔth.
Ɛkthtra̱k metɛbölai̱teth cie min ca lat nhial. Gɔ̱ri thuperna̱tɛn kä li̱ki̱öd krömatögra̱pi̱ buɔ̱l mi̱ lät ɛ gɔaa kɛ kui̱ ri̱thääcä metabölömikni̱. La̱tdɛ randɔm traitmɛn prötokɔ̱l kɛ tra̱th tha̱mpuɔl kɛl kɛ nämbär thëlli̱ ti̱ cäät kɛ ga̱ŋ batch i̱pɛktni̱. Cu nɛy ɛ la̱t kɛ thëm mi̱ gɔaa kä glöbal metɛbölai̱teth mëë ca ka̱m raar ni̱ wal kä AB SCIEX QTRAP 5500 Tripul Kuadrupöl Ma̱th I̱thpekti̱römi̱ti̱r (50). Krömatögra̱pik anali̱thi̱th kɛnɛ pi̱i̱k area integrɛciɔn cua kɛ la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ MultiKuant berciɔn 2.1 thɔpwɛɛr (Applaid Baöthi̱thtɛmni̱ SCIEX).
Ɛn ai̱ön kuën duŋ 1000 cua la̱t kɛ ma̱r kä min ci̱ bath kä metɛbölai̱te ba̱li̱ö, kɛnɛ ɣöö ɛn TIC duŋ tha̱mpuɔlä kɛl cua la̱t kɛ kalkulɛciɔn duŋ nɔrmalaidhed pi̱i̱k area duŋ metɛbölai̱te kärɔa min ca jiek kɛ riali̱dɛ i̱kä kɛ min ci̱ rɔ gɛr min ca nööŋ ɛ ini̱thtrumɛntal anali̱thi̱th kä tha̱mpuɔl pröthethiŋ. Kɛ kɔr kä mëë ca TIC jakä mi̱ thi̱a̱k, MetaboAnali̱thi̱thR(51) (depuɔlt parami̱ti̱r) ɛ mi̱ lät kɛ gër lɔga̱ri̱thmik kɛnɛ autömatik nɔrm lany i̱thkiɛli̱. Cu nɛy PCA la̱t kɛ vegan R pakɛmɛn kɛ la̱t ɣɛkplörɛtöri̱ anali̱thi̱th duŋ metabölöme dääk kam tha̱mpuɔli̱, kɛnɛ ɣöö cua tha̱a̱ŋ redundanci̱ anali̱thi̱th la̱t kɛ anali̱thi̱th jua̱thni̱. La̱tdɛ Ward methɔd kɛ lätni̱ ɣi̱th map dendrögra̱m kɛ mat Euclidean na̱n kam tha̱mpuɔli̱. Cu nɛy lät kɛ limma (52) kä i̱thtandardaidhed metɛbölai̱te abundancy kɛ ŋi̱e̱c metɛbölai̱teni̱ ti̱ ŋuan ti̱ gööl rɛy thëll ta̱a̱dɛ kɛɛliw kɛnɛ mai̱kröenba̱rɔnmɛn. Rɛy kä ɣöö ba latdɛ jakä thi̱a̱k, kɔn la̱tnɛ buɔ̱n mean parami̱ti̱r kɛ lɛy mödɛl, kɛnɛ ɣöö ba thëlli̱ ta̱a̱diɛn guic rɛy mai̱kröenba̱rɔnmɛn cie buɔ̱n kɛl (n = buɔ̱n 6); kɛ kui̱ thëm thi̱gni̱pi̱kan, cua thëm mi̱ ca luɔc kä diɔ̱k la̱t kɛ kui̱ metɛbölai̱te kärɔa Kɛ ɣöö ba repli̱këcin mi̱ kac kulɛ gaŋ, ɛn juey cua mat thi̱n cie mi̱ ɛ mi̱ gaŋkɛ rɛy li̱mma di̱dhaanyä. Rɛy kä ɣöö ba dääk rɛy metɛbölai̱teth kam jua̱thni̱ ti̱ gööl guic, cua limma mödɛl riali̱kä cu määni̱ jua̱th rɛy duɔ̱p mi̱ ca riali̱kä. Cu nɛy ɛ lat i̱ jɛn tëkɛ luɔt kä pre-i̱thpethi̱pi̱këd kɔni̱thtra̱th kam thëll ta̱a̱dɛ kɛnɛ mai̱kröenba̱rɔnmɛn duŋ Padj <0.05 (Benjamini-Ɣɔcberg kɔrreciɔn).
Kɛ kɔr kä mëë ca buɔ̱mdɛ jakä di̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ Miltenyi Dead Thëll Remöbal Kit (>80% bai̱bili̱ti̱), thi̱ŋgil-thëll tra̱ni̱thkri̱ptöm thi̱kuɛnthiŋ cua la̱t kä mat athciteth mi̱ ci̱ kööt kɛnɛ tuɔm tha̱mpuɔli̱ kɛ la̱tdɛ kɛɛ 10x 5'ji̱i̱n ɣɛkprɛciɔn prötökɔɔl. Kä ti̱ dhie̱e̱c ti̱ cäät ti̱o̱muɔri̱ kɛnɛ aththi̱teth cua kɛ die̱l guäc, cieŋni̱ min kuiy babili̱ti̱dɛ kä ti̱o̱muɔr tha̱mpuɔl kɛl cuɛ gaŋ i̱ ba mat thi̱n. Kɛ ɣöö ba jua̱th ti̱ ŋuan kulɛ kuany, cua tha̱mpuɔli̱ jua̱thni̱ kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱ mat rɛy lɛni̱ nyin 10x krömiöm kɔnti̱röllɛr, kɛnɛ ɣöö cua athciteth kɛnɛ tuɔm gua̱thni̱ diel guec kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱. Kɛ kɔr kä mëë ca thi̱kuɛnthiŋ [Illumina Ɣai̱Thek 4000 28×98 bp mi̱ ca mat kɛɛl (PE), Kuebek jenɔm; ɛ aberig duŋ 73,488 kɛnɛ 41,378 kuɛn kä thëll kɛl kɛ kui̱ ti̱o̱mä kɛnɛ aththi̱teth kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱]], kɔn cua la̱t kɛ ThëllSNP kɛnɛ Vireö (53) (bɛth kä ThëllSNP cie Kä min ŋa̱ckɛ kä raan SNP (VCF) min ca ŋun ɛ GRCh38 ɛ mi̱ ca la̱th ɛ la dönɔr ai̱denti̱ti̱ duŋ klöötaap jenölath rɛy kä SNPRBSi̱th (IBS), ɛ /thiɛlɛ thëlli̱ ti̱ /ka̱n la̱th lät kɛnɛ thëlli̱ tin ca ŋic cie duplɛkni̱ kɛnɛ mat dönari̱ kam athti̱teth kɛnɛ tuɔm tha̱mpuɔli̱ (54) Kä min tekä la̱t ɛmɛ, cua kɔnɛ ŋot kɛ mi̱ tekɛ thëlli̱ ti̱ ŋuan ti̱ cuŋ rɛy tuɔmä kɛnɛ athti̱teth kɛ kui̱ anali̱thi̱th mi̱ te piny (scCo5) cuɛ thëlli̱ 6975 nööŋ (2792 kɛnɛ 4183 thëlli̱ ti̱ bä kä tuɔm kɛnɛ athciteth, kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱) kɛ kui̱ anali̱thi̱th Kɔn cua la̱t kɛ igraph'ä (57) Louvain ki̱la̱thtɛriŋ duŋ nyuakdɛ min thi̱ääk kɛ nɛtwɔk (SNN) min tekä Jaccard di̱thtan ɛ wä kä ki̱la̱thtɛr thëlli̱ ɛ markɛtib anötaap ɛ latdɛ kä ki̱la̱thtɛr. kɛnɛ guäcdiɛn kɛ t-SNE Thai̱tötökthik T thëlli̱ kɛn cua kɛ lat ɛ latdɛ duŋ CD8A kɛnɛ GZMA, ɛ thiɛlɛ tha̱bki̱la̱thtɛri̱ tin tekɛ riböthɔm prötien latdɛ mi̱ tɔt Kɔn cua data ni̱ tëë ca ka̱m raar duŋ Izar et al (16), cu määni̱ t-SNE embeddiŋdiɛn, bɛ latdɛ öberlap kam thëll immi̱o̱n.
PBMC cua kɛ da̱a̱k kä leuköthai̱te thɛparɛciɔn pröda̱kni̱ (I̱THTEMCELL Tekinölöji̱ni̱) ɛ Pikɔll gi̱rɛdiɛn denthi̱ti̱ thɛnti̱ri̱pugɛcin. CD3 + thëlli̱ cua kɛ woc kä PBMC kɛ la̱tdɛ kɛɛ CD3 bi̱i̱dni̱ (Miltenyi). Rɛy kä min te thi̱n kiɛ thiɛlɛ MNA, CD3+ thëlli̱ cua kɛ la̱t kɛ plat-baund CD3 (5μg/ml), thɔ̱lubɔl CD28 (3μg/ml) kɛnɛ IL-2 (300 U/ml; Pröleukin). Kɛ cäŋ in jɔak kä rëpdɛ, ɛn babili̱ti̱ (Pi̱dhi̱bɔl Babili̱ti̱ Dai̱ ePluor450, eBaöthaany) kɛnɛ pröli̱perɛciɔn (123kuɛn eBeadni̱, Thermö Pi̱ther Thaanytipik) cua kɛ ɣɔ̱n ɛ plöw thai̱tömetri̱. Ɛvaluëth i̱ppɛktɔr pa̱ŋciɔn ɛ i̱thtimulatiŋ thëlli̱ kɛ PMA (20 ng/ml) kɛnɛ ai̱önömai̱thi̱n (1 μg/ml) kɛ Gölgi̱ I̱thtɔp kɛ thaakni̱ 4, kɛnɛ guic CD8-PerCP (RPA-T8, BaöLejɛn), CD4-AF700 (RPA-T4) , BaöPi̱tcöthi̱ɛn i (MAb11, bd). I̱thtimulaciɔn qPCR kɛnɛ Chip thëlli̱ kɛ PMA (20 ng/ml) kɛnɛ ai̱önömaithin (1μg/ml) kɛ thaakni̱ 4. Kä ELISA thuperna̱tɛn cua ruuli̱ ɛ ŋot kɛnɛ kɛ kɔr i̱thtimulaciɔn kɛ PMA (20 ng/ml) kɛnɛ ai̱önömaithin (1 μg/ml) kɛ thaakni̱ 4.
Guurɛ prötokɔ̱l ëë ca la̱t ɛ ram min lätdɛ kɛ ɣöö ba RNA da̱a̱k kɛ la̱tdɛ kɛɛ RNeasy Pla̱th Mini Kit (QIAGEN). La̱tdɛ QIAthrɛdɛr (QIAGEN) kɛ ɣömöjeni̱dhi̱öd tha̱mpuɔl. La̱tdɛ kɛɛ RNA mi̱ tekɛ lua̱ŋ-mi̱ di̱i̱t ɛ wä kä cDNA kit (Thermö Pi̱ther Thaanytipik) kɛ thänthei̱dhai̱d kɔmpi̱lɛmɛntɛri̱ DNA (cDNA). La̱tdɛ TaqMan Rapid Adbanth Mathtɛr Mik (Thermö Pi̱ther Thaanytipik) kɛ kuanti̱pi̱ ji̱i̱n ɣɛkpreciɔn (kɛ mëë ca lar ɛ manupakciɛr'ä prötökɔɔl) kɛ pröbni̱ ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042L215), Ɣ̱th02786624_g1 [gi̱lai̱thɛraldeɣaid-3-pöthpët mi̱ jiɛn kä Ɣai̱dröji̱n (GAPDH)] kɛnɛ Ɣ̱th01010726_m1 (SLC22A2). Kä tha̱mpuɔli̱ cua kɛ la̱t kä I̱thtɛpOnePla̱th ri̱i̱l-tai̱m PCR thi̱thtɛm (Applaid Baöthi̱thtɛmni̱) (Applaid Baöthi̱thtɛmni̱) rɛy Mai̱kröAmp pa̱th optikal 96-wɛll riakciɔn plat (Applaid Baöthi̱thtɛmni̱) kɛ Mai̱kröAmp optikal pilim. Ɛni̱ Ct ba̱li̱ö min läny 35 ba cu guic i̱ jɛn te nhial kä detekciɔn thrɛthɣo̱ld kɛnɛ ɣöö ba cu nyoth cie mi̱ /ca de jiek.
La̱tdɛ ChIP cie min ca lat ni̱ wän (58). Kɛ gua̱a̱th mi̱ ciɛk, kɛn thëlli̱ cua kɛ jakä gɔw kɛ pɔrmaldiɣaid (final kɔncentrɛciɔn 1.42%) kɛnɛ ɣöö cua kɛ inkubɛted rɛy lëthä duëël kɛ minitni̱ 10. La̱tdɛ tha̱pplemɛnted i̱thwɛliŋ bupper (25 mM Ɣepeth, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl kɛnɛ 0.1% NP-40) kä ɣaci̱ kɛ minitni̱ 10, kɛ kɔrɛ ba nyɔk kɛ la̱th rɛy immi̱o̱nöprecipi̱tɛciɔn bupper cie min ca lat (58). Kä tha̱mpuɔl cua kɛ kɔrɛ thɔ̱ni̱kɛted kɛ thärkäli̱ ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: thärkäli̱ 10 (20 1-thɛkɔnd pulthni̱) kɛnɛ thaak mi̱ cuŋ ɛ la 40 thɛkɔndi̱ni̱. Inkubɛt Chip-gi̱rɛd immi̱o̱glöbulin G (Thël Thi̱knaliŋ Tekinölöji̱; 1μl), ɣi̱thtɔn H3 (Thël Thi̱knaliŋ Tekinölöji̱; 3μl), NFAT (Inbi̱tröji̱n; 3μl) kɛnɛ SP1 (Thël Thi̱knaliŋ Tekinölöji̱; 3μl) ani̱buɔdi̱ni̱ kɛ tha̱mpuɔl CCn. Inkubɛt prötien A bi̱i̱dni̱ (Thermö Pi̱ther Thaanytipik) kɛ tha̱mpuɔl kä 4°C kɛ lëthdɛ mi̱ tɔt kɛ thaak 1, kɛ kɔrɛ bɛ lät kɛ chelex bi̱i̱dni̱ (Baö-Rad) kɛ rëp DNA, kɛnɛ ɣöö bɛ lät kɛ prötienath K (Thermö Pi̱ther) kɛ kui̱ prötien dai̱jɛciɔn. TNFα prömötɛr cua jiek ɛ PCR: nhiam, GGG TAT CCT TGA TGC TG TGT; kä min gua̱c, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp min ca nööŋ). Kä thurɛni̱ cua kɛ la̱t ɛ Image Lab (Baö-Rad) kɛnɛ ɣöö cua kɛ kuɛn kɛ la̱tdɛ kɛɛ ImageJ thɔpwɛɛr.
Kä thëll ka̱lciɛr thuperna̱tɛn cua ruuli̱ cie min ca lat nhial. Kä jiekdɛ cua la̱t kɛ mëë ca lar ɛ ram min lätdɛ duŋ raanä TNFα ELISA kit (Inbi̱tröjen), raan IL-2 ELISA kit (Inbi̱tröjen) kɛnɛ raan IFN-γ ELISA kit (Abcam). Kɛ mëë ca lar ɛ prötokɔ̱l ëë ca la̱t, ɛn thuperna̱tɛn cua jakä kuiy 1:100 kɛ jiek TNFα kɛnɛ IL-2, kɛnɛ 1:3 kɛ jiek IFN-γ. La̱tdɛ EnBi̱ciɔn 2104 Ma̱lti̱lɛbel Ri̱dɛr (PerkinElmer) kɛ thëm abdhɔrbɛnci̱ kä 450 nm.
PBMC cua kɛ da̱a̱k kä leuköthai̱te thɛparɛciɔn pröda̱kni̱ (I̱THTEMCELL Tekinölöji̱ni̱) ɛ Pikɔll gi̱rɛdiɛn denthi̱ti̱ thɛnti̱ri̱pugɛcin. CD3 + thëlli̱ cua kɛ woc kä PBMC kɛ la̱tdɛ kɛɛ CD3 bi̱i̱dni̱ (Miltenyi). Rɛy kä min te thi̱n kiɛ thiɛlɛ MNA, CD3+ thëlli̱ cua kɛ la̱t kɛ plat-baund CD3 (5μg/ml), thɔ̱lubɔl CD28 (3μg/ml) kɛnɛ IL-2 (300 U/ml; Pröleukin) kɛ ni̱n 3. Kɛ kɔr ni̱ni̱ da̱ŋ 3, cua thëlli̱ ruuli̱ kä cua kɛ lak kɛ 0.9% thalain, kä cua pellet jakä kɔ̱c. Thëll kuën cua la̱t ɛ plöw thai̱tömeti̱ri̱ (Thaitek Auröra; 3L-16V-14B-8R kɔni̱gi̱ra̱pɛciɔn) kɛ la̱tdɛ kɛɛ 123kuën eBeadni̱.
Ɛkthtra̱k metɛbölai̱teth cie min ca lat nhial. Kä ɣɛktra̱k ëë ci̱ kööt cua nyɔk kɛ loc thi̱n kä kɔncentrɛciɔn duŋ 4000 thëll ekui̱bɛlɛntni̱/μl. Anali̱thi̱th tha̱mpuɔl ɛ ribɛrthi̱d-pɛth krömatögra̱pi̱ (1290 Inpi̱ni̱ti̱ II, Agilɛn Tekinölöji̱thni̱, Thanta Klara, CA) kɛnɛ KORTEK T3 kɔlöm (2.1×150 mm, di̱t pa̱rti̱käl 1.6-μm, pöör di̱t 120-Å; #18600850,). Pölar ma̱th i̱thpekti̱römi̱ti̱r (6470, Agilɛn), min bi̱ elektröthprey aönaidhɛciɔn lät rɛy puɔ̱thi̱tip mödɛl. Mobail pɛth A ɛ 0.1% puɔrmik athi̱d (rɛy H2O), mobail pɛth B ɛ 90% acëtönitrail, 0.1% puɔrmik athi̱d. Kä LC gi̱rɛdiɛn ɛ 0 ɛ wä kä 2 minitni̱ kɛ kui̱ 100% A, 2 ɛ wä kä 7.1 minitni̱ kɛ kui̱ 99% B, kɛnɛ 7.1 ɛ wä kä 8 minitni̱ kɛ kui̱ 99% B. Kɛ kɔrɛ ba kɔlöm nyɔk kɛ i̱kui̱li̱brɛt kɛ mobail pɛth A kä ja̱l rɛt mi̱ 0.6 ml/min kɛ minitni̱ 3. . Kä ja̱lɛ ɛ 0.4ml/min, kɛnɛ ɣöö ɛn kɔlöm camber ɛ mi̱ ca leth ɛ wä kä 50°C. La̱tdɛ MNA'ä pi̱o̱o̱r kemi̱kal i̱thtandar (M320995, Toronto Rithääc Kɛmi̱kal Kɔmpanɛ, Nɔth Yɔ̱k, Öntariö, Kanada) kɛ yiɛth thaak in ba rɔm thi̱n (RT) kɛnɛ tra̱ni̱thpuɔrmɛciɔn (RT = 0.882 minitni̱, tra̱ni̱thpuɔrmɛciɔn 1 = 137→94.1, tra̱ni̱thpuɔrmɛciɔn 2 = 137→1372). Mi̱ ci̱ tra̱ni̱thi̱cini̱ diɔ̱k diaal tuɔɔk kɛ gua̱a̱th in lot rɔ kɛ rɔmdiɛn thi̱n, tra̱ni̱thi̱ciɔn 1 bɛ lät kɛ kua̱nti̱pi̱këcin kɛ lärɛ i̱ ɛ mi̱ ca lɛy. Kä i̱thtandar kurb duŋ MNA (Torontö Rithääc Kɛmi̱kal Kɔmpanɛ) cua jiek ɛ thi̱rial di̱luciɔni̱ bäkɛl nyin i̱thtɔk tha̱luciɔn (1 mg/ml) kɛ jiek i̱thtandardni̱ duŋ 0.1, 1.0, 10 kɛnɛ 100 ng/ml kɛnɛ 1.0 kɛnɛ 10 μg/ml kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱ ɛ la ti̱ lawlaw. Kä pek in ca jiek ɛ 1 ng/ml, kɛnɛ ɣöö min ca loc ɛ li̱ni̱e̱e̱r ɛ kam 10 ng/ml kɛnɛ 10μg/ml. Kä injɛkciɔn kɛl kä mai̱kröli̱ti̱ri̱ rɛw kä tha̱mpuɔl kɛnɛ i̱thtandar ɛ mi̱ la̱tkɛ kɛ kui̱ LC/MS anali̱thi̱th, kɛnɛ tha̱mpuɔl mi̱ ca li̱ɔɔm kɛ kuɔ̱li̱ti̱ kɔnti̱röl ɛ mi̱ la̱tkɛ ɛni̱ injɛkciɔni̱ bädäk kɛ jakdɛ kä cuŋ ɛ la plathpuɔm anali̱thi̱th. Kä MNA ri̱thpɔnthni̱ nyin MNA-treated thëlli̱ tha̱mpuɔli̱ diaal cukɛ te rɛy li̱ni̱e̱e̱r rɛnji̱ duŋ aththei̱. Data anali̱thi̱th cua la̱t kɛ la̱tdɛ kɛɛ MathƔuntɛr kua̱nti̱tɛtib anali̱thi̱th thɔpwɛɛr (v9.0, Agilent).
Kä ri̱c in rɛwdɛ αFR-CAR kɔni̱thtra̱kt cua naŋ kä Thɔŋ et al. (59). Rɛydɛ mi̱ ciɛk, ɛn kɔni̱thtra̱kt tëkɛ ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: CD8a bo̱o̱th thi̱kuɛnthi̱, raan αFR-i̱thpethi̱pik thi̱ŋgil-cɛɛn ba̱riabɔl pragmɛn, CD8a ɣi̱nji kɛnɛ tra̱ni̱thmembi̱ran ri̱jin, CD27 intrathëllular dɔmiɛn kɛnɛ CD3z intrathëllular dɔmiɛn. Kä CAR thi̱kuɛnthi̱ min ci̱ thuɔ̱k cua thänthei̱dhai̱d ɛ JenI̱thkript, kɛnɛ ɣöö kɛ kɔrɛ cua klɔn rɛy ri̱c-in rɛwdɛ kä lenti̱bai̱ral ɣɛkprɛciɔn bɛktɔr nhial kä GFP ɣɛkprɛciɔn kathtɛt mëë cua la̱t kɛ thëm tra̱ni̱thda̱kciɔn ɛppi̱ciɛnci̱.
Lenti̱bai̱ra̱th ɛ mi̱ la nööŋkɛ ɛ tra̱ni̱thpekciɔn duŋ HEK293T thëlli̱ [Amëri̱kan Taap Ka̱lciɛr Kɔllekciɔn (ATCC); cuɛ pith rɛy Dulbecco'ä mëë ca riali̱kä kä Eagle mëdiöm min te 10% fetal böbain thi̱ra̱m (FBS) kɛnɛ 1% PenI̱thti̱rep, kɛnɛ ɣöö cua la̱t kɛ CAR-GFP bɛktɔr kɛnɛ Kä pla̱thmidni̱ tin ca tɔ̱w (psPAX2 kɛnɛ pMD2.G, Addgene) cua la̱t kɛ li̱pöpɛkcin amina (Thi̱gma-Aldri̱c). Kä bai̱ra̱th-min tekɛ thuperna̱tɛn cua ruuli̱ kɛ kɔr thaakni̱ 48 kɛnɛ 72 kɛ kɔr tra̱ni̱thpekciɔn, cua pi̱li̱tɛr, kɛnɛ kɔncentrɛciɔn ɛ alti̱rathɛnti̱ri̱pugɛciɔn. Tɔw bai̱ral thuperna̱tɛn min ci̱ thi̱a̱a̱ŋ kä -80°C amääni̱ mi̱ cɛ tra̱ni̱thda̱kciɔn la̱t.
PBMC kɛn cua kɛ da̱a̱k kä puɔl pua̱a̱ny dönör leuköthai̱te thɛparɛciɔn pröda̱kni̱ (STEMCELL Tekinölöji̱ni̱) ɛ Pikɔll gi̱rɛdiɛn denthi̱ti̱ thɛnti̱ri̱pugɛcin. La̱tdɛ kɛɛ puɔ̱thi̱tib thɛlɛkciɔn CD8 mai̱kröbiedni̱ (Miltenyi) kɛ ai̱thölɛciɔn CD8+ thëlli̱ kä PBMC. I̱thtimulat T thëlli̱ kɛ Tra̱ni̱thAkt (Milteni̱) kɛnɛ rɛy TɛkthMACS mëdiöm [Milteni̱; cua mat thi̱n kɛ 3% lëth-inakti̱bɛted yuman thi̱ra̱m, 1% PenI̱thti̱rep kɛnɛ IL-2 (300 U/ml)]. Kɛ kɔr thaakni̱ ti̱ jiɛn rɛw wi̱dɛ ŋuaan kɛ kɔr i̱thtimulaciɔn, T thëlli̱ cua kɛ naŋ kɛ lɛnti̱bai̱ra̱th (10 μl kɔncentrated bai̱ra̱th thuperna̱tɛn kä thëlli̱ 106). 1 ɛ wä kä ni̱n 3 kɛ kɔr tra̱ni̱thda̱kciɔn kä Thai̱tek Auröra (kä FSC (Pɔrward I̱thkattɛr)/SSC (Tha̱a̱d I̱thkattɛr), Thi̱ŋgil, GFP+), cua GFP latdɛ duŋ thëlli̱ guic kɛ nyuɔ̱th tra̱ni̱thda̱kciɔn mi̱ ro̱ŋ mi̱ kuiy ni̱ jɛn kä 30%.
CAR-T thëlli̱ cua kɛ ka̱lciɛr kɛ thaakni̱ ti̱ 24 rɛy Immunokalt (STEMCELL Tekinölöji̱thni̱; cua mat kɛɛ 1% PenI̱thti̱rep) rɛy gua̱thni̱ ti̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: /ka̱nɛ riali̱kä, cua kɛ riali̱kä kɛ 250 μM adenöthin kiɛ 10 mM MNA. Kɛ kɔr kä mëë ca kɔn la̱th lät, cua CAR-T thëlli̱ lak kɛ PBS kä cua kɛ mat kɛɛ 20,000 SK-OV-3 thëlli̱ [ATCC; rɛy McCoy 5A mëdiöm (Thi̱gma-Aldri̱k) cua mat kɛɛ 10% FBS kɛnɛ 1% PenI̱thti̱rep kä 10: Kä i̱ppɛktɔr ɛ wä kä targɛt rɛci̱ö duŋ 1 cua jakä di̱t rɛy tri̱pli̱kët rɛy tha̱pplemɛnted Immi̱o̱nökalt mëdiöm. SK-OV-3 thëlli̱ kɛnɛ SK-OV-3 thëlli̱ cua kɛ li̱th kɛ di̱ji̱tali̱th thapönin (0.5mg/ml; Thigma-Aldri̱k) cua kɛ la̱t cie negɛtib kɛnɛ puɔ̱thi̱tip kɔnti̱röli̱, kɛ̈l kɛ̈ɛ̈li̱. Kɛ kɔr thaakni̱ ti̱ 24 ti̱ ca pith kɛɛl, cua thuperna̱tɛn ruuli̱ kɛnɛ ɣöö cua laktat deɣai̱dröjenathe (LDH) thɛm kɛ mëë ca la̱r ɛ ram ëë lätdɛ (LDH Glo Thai̱tötökthi̱ti̱ Aththey ​​Kit, Prömega). Kä LDH thuperna̱tɛn cua jakä kuiy 1:50 rɛy LDH bupper. Kä perthäntig kä näk cua thɛm kɛ la̱tdɛ kɛɛ puɔrmula mi̱ guɔ̱r kɛrɔ̱: perthäntig kä näk = perthäntig kä min ca riali̱kä / pek in di̱tni̱ jɛn kä näk x 100%, gua̱th in bi̱ perthäntig kä min ca riali̱kä = kö-ka̱lciɛr-T thëlli̱ kärɔ̱, kɛnɛ pek in di̱tni̱ jɛn kä näk = puɔ̱thi̱tib kɔnti̱röl-nɛgɛtip kɔnti̱röl.
Cie min ca lat rɛy gɔ̱rä kiɛ ŋɔak kɛnɛ ca̱a̱p, lätdɛ kɛɛ Gi̱ra̱pPad Pri̱dhi̱m 8, Microsoft Ɛkthel kiɛ R v3.6.0 kɛ kui̱ i̱thtathti̱thtikal anali̱thi̱th. Mi̱ ca tha̱mpuɔli̱ ti̱ ŋuan ruuli̱ kä jua̱th kɛl (cie mi̱ cie athti̱teth kɛnɛ ti̱o̱m), kɔn la̱tnɛ t thëm rɛw kiɛ mat jua̱th thi̱n cie mi̱ ɛ randɔm i̱pɛkt rɛy li̱ni̱e̱e̱r kiɛ jeneralaidhed mödɛl cie mi̱ lotdɛ rɔ. Kɛ kui̱ metabölömikni̱ anali̱thi̱th, ɛn thëm in gɔa ɛ mi̱ la̱tkɛ rɛy tri̱pli̱kët.
Kɛ kui̱ ŋɔaani̱ tin kɔ̱ŋ tin ba gɔ̱r piny kɛ kui̱ ruac ɛmɛ, guic http://adbances.sciencemag.org/cgi/kɔntɛn/full/7/4/eabe1174/DC1.
Nɛmɛ ɛ wargak mi̱ ca lɛp mi̱ ca da̱a̱k piny ŋuɔ̱tni̱ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, min nhɔk ɣöö ba la̱th lät, ba da̱a̱k kɛnɛ nyɔk kɛ lätni̱ rɛy duɔ̱p mi̱ dɔ̱ŋ, mi̱ ci̱ la̱tdɛ min jɔak /ciɛ kui̱ kä ɣöö ba kɔmmerciali̱ jiek kä min ca lat i̱ la̱tdɛ min nhiam ɛ mi̱ cuŋ. Min na̱ŋkɛ thuɔ̱k thin.
Ŋäc: Kɔn thiëc nɛy ji̱ kärɔa ɛn ɣöö biɛ la̱th kä email address kɛ ɣöö bi ram min ci la̱th lät ŋa̱c ɛn ɣöö go̱ri ɣöö bɛ emaildu nɛn kä /ciɛ spam. /Ci̱ nɛy ɛ bi käp kɛ email addressni̱.
Thiec ɛmɛ lätdɛ kɛ ɣöö ba ji̱ thɛm mi ɛ ji̱n ram mi ci ben kä ba ji̱ gaŋ kä ɣöö biɛ la̱th lät.
Maritha K. Kilgɔr (Maritha K. Kilgɔr), Thara MakPerthɔn (Thara MakPerthɔn), Lɔrɛn G. Dhakari̱ath (Lɔrɛn G. Dhakari̱ath), Abi̱gail Ɛli̱ Ari̱th G. Watthɔn (Ɣ. Watthɔn), Jɔ̱ɔ̱n I̱thtag (Jɔ̱ɔ̱n I̱thtag), Brɛd Ɣ. Jɔnethn (Brad Ɣ. Nɛlthɔn), Ralp J. De Bɛll (Raththel G. Jɔɔneth), Pi̱i̱niath T. Ɣa̱miltɔn (Pi̱i̱niath T.
MNA luäkɛ kɛ ga̱ŋ pua̱a̱ny T thëlli̱ kɛnɛ ɣöö cuŋɛ la mi̱ bum kä immi̱o̱nötherapi̱ min görkɛ kɛ jak ka̱nthɛrä ran kä gɔaa.
Maritha K. Kilgɔr (Maritha K. Kilgɔr), Thara MakPerthɔn (Thara MakPerthɔn), Lɔrɛn G. Dhakari̱ath (Lɔrɛn G. Dhakari̱ath), Abi̱gail Ɛli̱ Ari̱th G. Watthɔn (Ɣ. Watthɔn), Jɔ̱ɔ̱n I̱thtag (Jɔ̱ɔ̱n I̱thtag), Brɛd Ɣ. Jɔnethn (Brad Ɣ. Nɛlthɔn), Ralp J. De Bɛll (Raththel G. Jɔɔneth), Pi̱i̱niath T. Ɣa̱miltɔn (Pi̱i̱niath T.
MNA luäkɛ kɛ ga̱ŋ pua̱a̱ny T thëlli̱ kɛnɛ ɣöö cuŋɛ la mi̱ bum kä immi̱o̱nötherapi̱ min görkɛ kɛ jak ka̱nthɛrä ran kä gɔaa.
©2021 Amëri̱ka Aththöciëcin kɛ kui̱ Adbanthmɛn duŋ Thaany. cuŋ diaal ca kɛ tɔ̱w. AAAS ɛ ram kɛl kä HINARI, AGORA, OARE, CORUS, CLOCKSS, CrossRep kɛnɛ COUNTER. ThaanyAdbanthni̱ ISSN 2375-2548.